Leukocyte cytokine expression is associated with severity of autism in children

Full Text

Введение

Расстройства аутистического спектра (РАС) – это сложные нарушения развития нервной системы с неизвестной этиологией, высокой клинической гетерогенностью и выраженными аберрациями иммунной системы [6].

В течение нескольких десятилетий исследования в популяциях людей и на животных моделях продемонстрировали доказательства нарушений в функционировании врожденной и адаптивной иммунной систем при РАС, включая активацию иммунных клеток, продукцию аутоантител, дисбаланс цитокинов и хемокинов как в мозге, так и на периферии [10]. Согласно теории материнской иммунной активации (МИА), инфекции и некоторые эпигенетические процессы могут вызывать сильный провоспалительный ответ матери во время беременности, что потенциально увеличивает риск развития РАС у плода [7]. Более того, авторами было показано, что повышенная активация Тh1-лимфоцитов и нарушение баланса Т-эффекторных/Т-регуляторных клеток связана с более выраженными поведенческими нарушениями при РАС [5, 6]. Доказательства связи между иммунной дисфункцией и поведенческими чертами подчеркивают необходимость дальнейшего изучения функциональной активности популяций иммунных клеток, для поиска механизмов патогенеза и потенциальных мишеней для терапии при РАС [8].

Цель исследования – определить уровни экспрессии IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-18, IFNγ и TNFα в лейкоцитах периферической крови детей с легким и тяжелым течением РАС.

Материалы и методы

Набор детей с РАС проводили в МБУ СО социально-реабилитационный центр «Здоровье» г. Челябинск. Критериями включения в группу РАС были: диагнозы по МКБ-10: F84.0 – Ранний детский аутизм, F84.1 – Атипичный аутизм и F83,1 – Задержка психоречевого развития с аутистически подобным поведением; отсутствие выявленных генетических нарушений и тяжелых соматических патологий; отсутствие аллергических реакций и острых респираторно-вирусных инфекций на момент обследования. При оценке тяжести состояния на основе рейтинговой шкалы оценки детского аутизма (CARS) из 81 человека (77,8% мальчиков) в возрасте 3-14 лет (медианный возраст 6,0 лет), 51 ребенок (63,0%) имел легкие симптомы аутизма (средний балл CARS 32,0±1,5) и 30 детей (37,0%) – тяжелые симптомы РАС (средний балл CARS 39,0±3,4).

Контрольную группу составили 45 детей (71,1% мальчиков) с типичным нейроразвитием (ТРД) в возрасте 4-13 лет (медианный возраст 9,0 лет), не имеющих тяжелых соматических заболеваний и психопатологий; с отсутствием аллергических реакций и острых респираторно-вирусных инфекций на момент обследования. Группы были сопоставимы по полу, но возраст ТРД был значимо выше, чем у детей с РАС. Набор в исследование осуществлялся после подписания родителями или законными представителями детей информированного согласия.

В качестве материала для исследования использовали 4 мл венозной крови, собранной после ночного голодания между 08:00–09:00 часами утра в пробирки с консервантом К₃ЭДТА. Получение фракции лейкоцитов из цельной крови, выделение общей РНК, оценку ее количества и качества осуществляли стандартными методами, как описано ранее [1]. Уровень экспрессии мРНК цитокинов: IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-18 IFNγ и TNFα определяли методом ПЦР в реальном времени с использованием реактивов для количественной ПЦР с SYBRGreen («Синтол», Москва) на приборе ДТ-прайм («ДНК-диагностика», Москва). Программа для амплификации, а также праймеры для мРНК цитокинов и гена домашнего хозяйства (GAPDH) были взяты из статьи Plotnikova и соавт. [9]. Относительные уровни экспрессии генов цитокинов рассчитывали с использованием метода прямого сравнения результатов реакции для целевого и контрольного генов: 2-∆∆CT.

В ходе статистического анализа для приведения данных к нормальному распределению, показатели трансформировали по Боксу–Коксу. Для вычисления среднего значения и 95% доверительного интервала (ДИ) проводили наивную ретрансформацию. Значимость различий между группами оценивали в ходе однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA) с апостериорными попарными сравнениями методом Данна. Двумерные корреляции между уровнями экспрессии цитокинов в лейкоцитах периферической крови и концентрацией цитокинов в плазме крови оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Различия считали статистически значимыми при р ≤ 0,05. Все расчеты выполнены в программе PAST v. 4.09.

Результаты и обсуждение

Хотя РАС не являются классическими иммуноопосредованными расстройствами, данные литературы убедительно свидетельствуют о нарушении двунаправленных взаимодействий между иммунной и центральной нервной системами (ЦНС) при РАС, что приводит к хроническому слабовыраженному воспалению, как в ЦНС, так и на периферии [3]. Ранее нами также было показано, что дети с тяжелым течением РАС (согласно CARS) демонстрировали высокие уровни IFNγ и IL-6 в плазме крови, что может отражать наличие у них системного хронического низкоуровневого воспаления [2].

В настоящем исследовании нами предпринята попытка оценить влияние воспалительного окружения на цитокиновую функцию лейкоцитов периферической крови или их возможный вклад в системный воспалительный потенциал у детей, в зависимости от наличия/отсутствия РАС и его тяжести.

Профили экспрессии мРНК цитокинов: IL-6, IL-1β, IL-18, IL-2, TNFα, IFNγ, IL-4 и IL-10, в лейкоцитах периферической крови детей с РАС и ТРД представлены в таблице 1.

 

ТАБЛИЦА 1. ЭКСПРЕССИЯ ЦИТОКИНОВ ЛЕЙКОЦИТАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ДЕТЕЙ С РАЗНОЙ СТЕПЕНЬЮ ТЯЖЕСТИ РАССТРОЙСТВ АУТИСТИЧЕСКОГО СПЕКТРА, M (95% ДИ)

TABLE 1. PERIPHERAL BLOOD LEUKOCYTES CYTOKINE EXPRESSION WITH DIFFERENT SEVERITY AUTISM SPECTRUM DISORDERS AT CHILDREN, M (95% CI)

Показатель, у. е. Indicator, c. u.	ТРД TDC (n = 45)	Легкое течение РАС Mild ASD (n = 51)	Тяжелое течение РАС Severity ASD (n = 30)	one-way ANOVA
				F (df1-df2)	p
IL-6	5,05 (3,06-8,23)	7,80 (5,06-11,45)	9,28 (4,91-15,99)	0,525 (2-123)	0,593
IL-1β	5,35 (3,35-8,35)	2,15* (1,41-3,16)	2,13* (1,37-3,15)	8,259 (2-123)	< 0,001
IL-18	0,04 (0,02-0,09)	0,01* (0,006-0,020)	0,01* (0,005-0,030)	4,354 (2-123)	0,015
TNFα	0,66 (0,49-0,89)	0,40* (0,30-0,54)	0,51 (0,36-0,74)	3,087 (2-123)	0,049
IFNγ	11,55 (7,24-17,23)	18,80 (13,14-25,34)	31,51* ** (23,32-40,86)	8,01 (2-123)	< 0,001
IL-2	6,46 (4,70-8,56)	3,03* (2,19-4,29)	3,08* (1,98-4,60)	3,419 (2-123)	0,036
IL-4	1,40 (1,10-1,79)	1,28 (0,96-1,68)	1,19 (0,83-1,75)	0,645 (2-123)	0,527
IL-10	11,23 (9,09-13,68)	9,00 (7,41-10,76)	11,35 (8,46-14,82)	1,963 (2-123)	0,145

Примечание. ТРД – дети с типичным нейроразвитием, РАС – расстройства аутистического спектра; * – значимые различия между показателями ТРД и детей с РАС (р ≤ 0,05); ** – значимые различия между показателями детей с легким и тяжелым течением аутизма (р ≤ 0,05).

Note. TDC, typical neurodevelopment children; ASD, autism spectrum disorders; *, significant differences between the indicators of TDC and children with ASD (p ≤ 0.05); **, significant differences between the indicators of children with mild and severe autism (p ≤ 0.05).

 

Оценка зависимости между уровнями экспрессии цитокинов в лейкоцитах и их концентрацией в плазме у всех обследованных групп детей показала, что уровни экспрессии IL-6 (r = 0,205; p = 0,021), IFNγ (r = 0,175; p = 0,044), IL-1β (r = 0,195; p = 0,028) и IL-4 (r = 0,369; p = 0,012) имеют значимые корреляции между плазмой и лейкоцитами. Такие результаты, как продемонстрировано Kutuk M.O. и соавт. [4], могут, вероятно, говорить о вкладе лейкоцитов в системный воспалительный потенциал.

При анализе уровней экспрессии установлено, что в лейкоцитах детей с РАС, не зависимо от тяжести состояния (легкое/тяжелое течение), значимо снижена экспрессия провоспалительных цитокинов – IL-1β, IL-18 и IL-2, по сравнению с аналогичными показателями ТРД. Кроме того, у детей с легким течением РАС обнаружена низкая экспрессия TNFα по сравнению с ТРД (табл. 1).

Тяжесть симптомов по шкале CARS у детей с РАС нашла отражение только в уровнях экспрессии IFNγ, которые в лейкоцитах периферической крови детей с тяжелым течением РАС были значимо повышены, как по сравнению с ТРД, так и по сравнению с детьми с легким течением РАС (табл. 1). В уровнях экспрессии IL-4, IL-6, и IL- 10 значимых различий между группами не обнаружено (табл. 1).

При дополнительной оценке влияния возраста на экспрессию цитокинов лейкоцитами в каждой группе детей (согласно классификации ВОЗ: до 6 лет, 7-12 и > 13 лет) значимых различий не обнаружено, что согласуется с данными Kutuk M.O. и соавт. [4].

Заключение

Таким образом, полученные нами данные могут свидетельствовать о значительной дисрегуляции цитокиновой функции лейкоцитов периферической крови у детей с РАС, которая имеет выраженные отличия в зависимости от тяжести симптомов РАС и, вероятно, может быть отражением наличия/отсутствия воспалительного потенциала на периферии.

Так, у детей с легким течением РАС, нами не обнаружено повышения уровней провоспалительных цитокинов в плазме крови, что, видимо, поддерживается низкими уровнями экспрессии основных провоспалительных цитокинов: IL-1β, IL-18, TNFα и IL-2 в лейкоцитах.

У детей с тяжелым течением РАС, напротив, показано системное низкоуровневое воспаление, которое обусловлено, прежде всего, высокими концентрациями в плазме крови IFNγ и IL-6, на фоне низких значений противовоспалительного цитокина – IL-10. Профиль экспрессии цитокинов лейкоцитами детей с тяжелым течением РАС продемонстрировал высокие уровни IFNγ – основного цитокина Тh1-лимфоцитов, на фоне низких значений экспрессии провоспалительных цитокинов: IL-1β, IL-18 и IL-2, без повышения экспрессии важного цитокина Тreg-лимфоцитов – IL-10. Согласно данным литературы, активация Тh1 адаптивного иммунного ответа без компенсации цитокинами Тreg-лимфоцитов, численность которых снижена при РАС, может приводить к усилению воспаления, в том числе в ЦНС, и коррелирует с тяжестью клинических симптомов РАС [5, 6]. Кроме Th1-лимфоцитов, продуцентами IFNγ могут выступать естественные киллеры, численность которых по данным Nie Z.K. и соавт. также повышена у детей с РАС [8].

Высокие концентрации IL-6 в плазме крови детей с тяжелым течением РАС могут быть ассоциированы не только с экспрессией данного цитокина лейкоцитами периферической крови (уровни экспрессии которого не имеют значимых различий между группами), но и его продукцией другими клетками организма, прежде всего, эндотелием сосудов.

Несмотря на обширные данные, свидетельствующие о дисрегуляции иммунной системы, необходимы дальнейшие исследования, для выявления взаимосвязи между функционированием популяций иммунных клеток и патобилогией РАС [4].

About the authors

Yuliya Y. Filippova

Chelyabinsk State University

Author for correspondence.
Email: julse@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-5041-6440

PhD (Biology), Associate Professor, Department of Microbiology, Immunology and General biology, Faculty of Biology, Chelyabinsk State University

Russian Federation, Chelyabinsk

A. S. Alekseeva

Chelyabinsk State University

Email: 96_anya@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2524-8569

Postgraduate Student, Department of Microbiology, Immunology and General Biology, Faculty of Biology, Chelyabinsk State University

Russian Federation, Chelyabinsk

A. L. Burmistrova

Chelyabinsk State University

Email: burmal@csu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6462-9500

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Department of Microbiology, Immunology and General Biology, Faculty of Biology, Chelyabinsk State University

Russian Federation, Chelyabinsk

References

Supplementary files