Immunomodulatory properties of splenocytes treated with chlorpromazine in experimental aggression

Full Text

Введение

Агрессивное поведение – это инстинктивно обусловленный паттерн поведения, тесно связанный с многочисленными физиологическими процессами, такими как защита территории, пищи и потомства, которые помогают животным выживать и размножаться. Агрессивное поведение, с другой стороны, считается одним из центральных симптомов многих нервно-психических расстройств – пограничных расстройств личности, аутизма, шизофрении, аффективных расстройств, включая посттравматический синдром и депрессию. Последствия агрессии ложатся тяжелым бременем на пациентов, их семьи и врачей. Агрессия является серьезной медико-биологической проблемой, связанной как с высокой частотой и тяжестью проявлений, так и с отсутствием средств избирательной коррекции [3, 4, 15].

Множество данных клинико-лабораторных исследований подтверждают связь между хроническими стрессорами, нервно-психическими расстройствами и нарушением функционирования иммунной системы, наряду с изменением синтеза нейротрансмиттеров, факторов роста, гормонов. Так, агрессивное поведение, в условиях социального стресса или у генетически агрессивных мышей NC900 связано с активацией иммунного ответа на Т-зависимые антигены, повышением пролиферации Т-клеток, перераспределением субпопуляций Т-лимфоцитов в костном мозге, периферической крови и селезенке. Также было выявлено, что иммунная дисфункция при агрессивном поведении связана с изменением баланса цитокинов, синтезируемых иммунными клетками и клетками головного мозга. Так, у индивидуумов с высоким уровнем агрессивности выявляли повышенные уровни провоспалительных цитокинов. У агрессивных животных регистрировали более высокую скорость заживления ран, чем у низкоагрессивных. При этом также наблюдался повышенный уровень ряда провоспалительных цитокинов (IL-1â, IL-2, IL-6, IFNã, TNFá) [5, 6, 13, 14].

Разработанный в последние десятилетия экспериментальный подход, заключающийся в получении мышами-самцами многократного опыта побед в ежедневных внутривидовых противостояниях, позволил сформировать у них агрессивный тип поведения. Исследования таких животных показали наличие у них целого ряда общих нейробиологических механизмов с людьми, характеризующимися высоким уровнем агрессивности. Вероятно, видоспецифичными и отличающимися у человека и животных являются лишь факторы, провоцирующие и запускающие агрессивное поведение [8, 13, 14, 15]. Ведущими звеньями патогенетического механизма агрессии являются нарушение регуляции продукции цитокинов, нейромедиаторов, нейропептидов, действие которых опосредовано клеточными элементами иммунной системы. Дальнейшее изучение патогенетических механизмов формирования агрессивного поведения и поиск подходов к его коррекции в рамках нейроиммунного взаимодействия в настоящее время чрезвычайно актуальны. Ранее нами была продемонстрирована возможность редактирования агрессивного поведения у животных трансплантацией обработанных хлорпромазином иммунных клеток, что сопровождалось изменением содержания цитокинов в некоторых структурах мозга этих животных [1, 2, 9, 10].

Целью настоящего исследования была оценка функционального фенотипа иммунных клеток, обработанных хлорпромазином, у агрессивных животных in vitro, а также влияние трансплантации этих клеток на функциональную активность клеток иммунной системы сингенных агрессивных реципиентов.

Материалы и методы

Мышей-самцов (CBA×C57BL/6) F1 в возрасте 4 мес., с массой 25-30 г, полученных из ветеринарного хозяйства ФГБНУ им. Гольдберга НИИ фармакологии и регенеративной медицины Томского национального исследовательского медицинского центра РАН (Томск, Россия), содержали в клетках группами по десять животных на стандартном рационе питания, со свободным доступом к воде и пище, естественным световом режиме. Все протоколы исследований соответствовали регламентирующим документам по работе с экспериментальными животными (Страсбург, 1986 г.). Агрессивное поведение формировали у активных мышей (n = 48) в результате повторного опыта побед в агонистических взаимодействиях с субмиссивным партнером в течение 20 дней, как описано N.N. Kudryavtseva и соавт. [7]. Далее агрессивных животных для предотвращения агонистического взаимодействия изолировали в индивидуальные клетки и использовали в качестве доноров и реципиентов иммунных клеток. Иммунные клетки получали в стерильных условиях из суспензии клеток селезенки агрессивных животных, прекультивированных с раствором хлорпромазина 25мг/мл (ОАО «Новосибхимфарм», Россия), представляющим собой нейролептик группы фенотиазинов алифатического ряда, в дозе 150 мкг на 15 × 10⁶ клеток с 3% FCS (Hyclone) в течение 25 минут, как описано нами ранее [1, 2]. Оценку уровня спонтанной и митоген-индуцированной пролиферации клеток проводили стандартным методом, по включению радиоактивной метки (Н³-тимидин). Количественное содержание цитокинов в образцах надосадочной жидкости культур клеток, обработанных хлорпромазином, определяли методом иммуноферментного анализа с использованием соответствующих тест-систем для определения IFNy, IL-6, IL-2 – eBioscience, Bender MedSystems (Австрия), для определения IL-1â, IL-10, TNFa – R&D Systems Inc., (Великобритания) в соответствии с рекомендациями производителей. Далее агрессивным сингенным реципиентам внутривенно вводили спленоциты, прекультурированные с хлорпромазином. Контрольной группе животных вводили спленоциты, прекультивированные в аналогичных условиях, без добавления хлорпромазина. Интенсивность гуморального и клеточного иммунного ответа у сингенных агрессивных реципиентов оценивали стандартными методами, путем подсчета относительного и абсолютного количества антителообразующих клеток селезенки (АОК) и выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в ответ на введение Т-зависимого антигена (эритроциты барана). Статистическая обработка полученных данных была проведена с использованием парного критерия Манна–Уитни (Mann–Whitney U test) для двух независимых выборок (программное обеспечение Statistica для Windows 10.0). Различия считали статистически значимыми при р < 0,05 и представляли как среднее значение S±M.

Результаты и обсуждение

В результате проведенных экспериментов было установлено, что хлорпромазин in vitro подавлял митоген-стимулированную пролиферативную активность спленоцитов агрессивных мышей, не изменяя при этом уровня спонтанной пролиферации (рис. 1). Также было выявлено, что после обработки хлорпромазином in vitro спленоциты агрессивных мышей характеризовались снижением продукции ряда цитокинов – IL-6, IL-2 и IFNã (рис. 2). Следовательно, прекультивирование спленоцитов агрессивных мышей с хлорпромазином вызывает изменение функциональной активности этих клеток.

 

Рисунок 1. Пролиферативная активность (имп/мин) спленоцитов агрессивных мышей (CBA×C57BL/6) F1 после обработки хлорпромазином in vitro

Примечание. ■ – клетки, прекультивированные без хлорпромазина (контрольная группа). ■ – клетки, обработанные in vitro хлорпромазином (150 мкг/15 × 106 клеток – экспериментальная группа); n = 12 в каждой группе; * – р < 0,05; ** – p < 0,01 между контрольной и опытной группами клеток (U-критерий Манна–Уитни).

Figure 1. Proliferative activity (cpm) of splenocytes of aggressive (CBA×C57BL/6) F1 mice after the chlorpromazine treatment in vitro

Note. ■, cells precultured without chlorpromazine (control group). ■, cells treated in vitro with chlorpromazine (150 µg/15 × 10⁶ cells – experimental group); n = 12 in each group; * – p < 0.05; ** – p < 0.01 between the control and the experimental groups of cells (Mann–Whitney U test).

 

Рисунок 2. Продукция цитокинов (пг/мл) спленоцитами агрессивных мышей (CBA×C57Bl/6) F1 после обработки хлорпромазином in vitro

Примечание. См. примечание к рисунку 1.

Figure 2. Cytokine production (pg/mL) by splenocytes of aggressive mice (CBA×C57Bl/6) F1 after the chlorpromazine treatment in vitro

Note. As for Figure 1.

 

Учитывая описанную выше важную роль нарушений функционального состояния клеток иммунной системы в формировании агрессивного поведения, далее мы изучали интенсивность гуморального и клеточного иммунного ответа и пролиферативную активность спленоцитов у агрессивных реципиентов после трансплантации сингенных спленоцитов, обработанных хлорпромазином. В результате проведенных исследований было зарегистрировано снижение интенсивности гуморального иммунного ответа, что оценивалось по уменьшению как относительного, так и абсолютного количества АОК в селезенке; при этом достоверных изменений в выраженности реакции ГЗТ у агрессивных реципиентов не отмечалось (табл. 1). Также было установлено снижение спонтанной (718,9±29,9 имп/ мин и 441,5±34,5 имп/мин соответственно, в контрольной и опытной группах; р < 0,05), ConA-стимулированной (17381,7±998,6 имп/ мин и 12247,3±854,5 имп/ мин в контрольной и опытной группах соответственно; р < 0,05) и ЛПС-стимулированной (2986,29±132,94 имп/ мин и 1651,09±113,26 имп/ мин в контрольной и опытной группах, соответственно; р < 0,05) пролиферации спленоцитов агрессивных реципиентов. Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что наряду со снижением функциональной активности иммунных клеток агрессивных животных, вызванной хлорпромазином, данные клетки при трансплантации реципиентам индуцируют снижение функциональной активности их клеток иммунной системы, что выражается в снижении интенсивности гуморального иммунного ответа и пролиферативной активности. Полученные в данной работе результаты согласуются с нашими данными, полученными ранее, свидетельствующими о том, что трансплантация спленоцитов с модулированной хлорпромазином in vitro функциональной активностью сингенным агрессивным реципиентам вызывала снижение митоген-стимулированной продукции их спленоцитами цитокинов – IL- 4, IL-6, IL-10, IL-2 и IFNy. Мы полагаем, что изменение функциональной активности последних может быть связано с хомингом трансплантированных клеток селезенки донора и их межклеточным контактом с клетками селезенки реципиента. Эту гипотезу подтверждают наши данные по визуализации прекультивированных с хлорпромазином и меченных флуоресцентным красителем карбоксифлуоресцеином спленоцитов агрессивных доноров в селезенке сингенных агрессивных реципиентов [2]. Кроме того, изменение функциональной активности клеток иммунной системы может быть следствием опосредованного влияния ЦНС, ее гормонов и нейромедиаторов на иммунитет при агрессии.

 

Таблица 1. Гуморальный и клеточный иммунный ответ у агрессивных сингенных реципиентов (CBA×C57Bl/6) F1 после трансплантации спленоцитов, обработанных in vitro хлорпромазином

Table 1. HUMORAL AND CELLULAR IMMUNE RESPONSE IN AGGRESSIVE SYNGENEIC (CBA×C57Bl/6) F1 RECIPIENTS AFTER TRANSPLANTATION OF SPLENOCYTE, TREATED WITH CHLORPROMAZINE IN VITRO

Параметр Parameter	Контрольная группа реципиентов Control group of recipients	Экспериментальная группа реципиентов Experimental group of recipients
Относительное количество АОК (АОК/106) Relative number of AFC (AFC/106)	881,18±270,46	545,58±183,29*
Абсолютное количество АОК Absolute number of AFС	104298,75±1571,35	71784,05±2648,30*
Уровень реакции ГЗТ (%) DTH response rate (%)	45,50±4,92	53,00±2,62

Примечание. Контрольная группа реципиентов – агрессивные реципиенты после трансплантации сингенных спленоцитов, предварительно культивированных без хлорпромазина. Экспериментальная группа реципиентов – агрессивные реципиенты после трансплантации сингенных спленоцитов, предварительно культивированных с хлорпромазином; n = 15-18 в каждой группе; * – р < 0,05 относительно соответствующего показателя в контрольной группе.

Note. The control group of recipients – aggressive recipients after transplantation of syngeneic splenocytes previously cultured without chlorpromazine. Experimental group of recipients – aggressive recipients after transplantation of syngeneic splenocytes pre-cultured with chlorpromazine; n = 15-18 in each group; *, p < 0.05 relative to the corresponding indicator in the control group.

 

Заключение

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о ингибирующем влиянии хлорпромазина на функциональную активность иммунных клеток агрессивных мышей, а также о положительном иммуномодулирующем действии трансплантации обработанных хлорпромазином иммунных клеток при агрессивном поведении у экспериментальных животных.

About the authors

E. V. Serenko

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Author for correspondence.
Email: serenko.evgeniy@mail.ru

Junior Research Associate, Neuroimmunology Laboratory

Russian Federation, Novosibirsk

I. A. Goldina

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: serenko.evgeniy@mail.ru

Research Associate, Neuroimmunology Laboratory

Russian Federation, Novosibirsk

E. V. Markova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: serenko.evgeniy@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Chief Research Associate and Head of Neuroimmunology Laboratory

Russian Federation, Novosibirsk

References

Supplementary files