Antibodies against benzo[a]pyrene, estradiol and progesterone: potential predictors of breast cancer progression?

Full Text

Исследование выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации по государственному заданию (проект FWEZ-2026-0004).

Введение

Одним из приоритетных направлений в клинической онкологии является исследование прогностических биомаркеров, обеспечивающих персонифицированный подход к лечению рака. В частности, иммуногистохимческий анализ рецепторов эстрадиола и прогестерона (ER и PR) и маркера клеточной пролиферации протеина Ki-67 необходим для определения молекулярно-биологического подтипа рака молочной железы (РМЖ) [2, 3, 6]. Поскольку для прогрессии РМЖ характерно снижение количества опухолевых клеток, экспрессирующих ER и PR, и увеличение Ki-67-положительных клеток [7, 8, 14, 16], поиск предикторов таких изменений опухоли по мере развития заболевания может оказаться полезным для своевременной коррекции его лечения.

Общеизвестно участие стероидных гормонов и стероид-связывающего глобулина сыворотки крови в возникновении и росте РМЖ [10, 12, 13, 19]. Гораздо менее изученной остается роль ауто-антител против химических канцерогенов и стероидных гормонов в прогрессии РМЖ.

Основанием для исследования предикторного значения таких антител служит следующее. Очевидно, что изменения экспрессии ER, PR и Ki-67 обусловлены нарушениями в генетическом аппарате трансформированных клеток, вызываемыми, в том числе, образованием ДНК-аддуктов метаболитов химических канцерогенов (в частности бензо[а]пирена, Bp) и стероидных гормонов у здоровых людей и больных РМЖ и другими злокачественными новообразованиями [11, 17, 18, 20]. Низкомолекулярные соединения, ковалентно связанные с макромолекулярным носителем, становятся гаптенами и приобретают способность индуцировать синтез специфических антител. Уместно предположить, что индивидуальные особенности образования гаптен-специфических антител могут быть взаимосвязанными с нарушениями экспрессии опухолевыми клетками некоторых белков, в том числе ER, PR и Ki- 67 в процессе роста и метастазирования РМЖ.

Ранее нами было обнаружено, что одновременное превышение уровней антител класса А против Bp и E2 над уровнями антител против Pg в сыворотке крови у больных ER⁺/PR⁺ РМЖ в I стадии встречалось чаще, чем у здоровых женщин [4], и реже у больных с ER⁺ опухолями на II-IV стадиях, чем в начале заболевания [5]. Однако взаимосвязи указанных антител с количеством в опухоли Ki-67-положительных клеток не были изучены. За рамками предварительных исследований в этом направлении остались гаптен-специфические антитела класса G. Не было проведено сравнение предикторной роли антител, специфичных к Bp, E2 и Pg с таковой у самих гормонов, E2 и Pg.

Цель исследования – выявить предполагаемые взаимосвязи индивидуальных уровней антител классов A и G против Bp, E2 и Pg, а также E2 и Pg в сыворотке крови больных РМЖ с нарушениями экспрессии ER, PR и Ki-67 в опухоли при ее прогрессии.

Материалы и методы

Объектом для исследования в настоящей работе послужила сыворотка крови 1574 женщин в постменопаузе с первично установленным диагнозом «инвазивная карцинома молочной железы неспецифического типа». Все женщины впервые обратились в Кузбасский клинический онкологический диспансер г. Кемерово. По TNM классификации были выявлены I и II стадии заболевания в 45,8% и в 39,2% случаев соответственно, III и IV стадии были выявлены у 13,6% и 1,4% женщин соответственно. Рецепторный статус опухоли (ER⁺/^-, PR⁺/^-) и маркер пролиферативной активности опухолевой клетки Ki-67 были определены с помощью стандартного иммуногистохимического метода в патологоанатомическом отделении. Медиана возраста всех женщин составила 65 лет (интерквартильный размах 59-70 лет).

Для исследования у женщин забиралась венозная кровь согласно этическим стандартам в соответствии с Хельсинкской декларацией (редакция 2013 г.) и в соответствии с Правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными Приказом Минздрава РФ № 266 от 19.06.2003. Все женщины предоставили информированное письменное согласие на участие в данном исследовании.

Иммуноанализ антител класса А и G против Bp, E2 и Pg (IgА-Bp, IgА-E2, IgА-Pg, IgG-Bp, IgG-E2 и IgG-Pg) определяли с помощью неконкурентного иммуноферментного анализа по описанной в работе [1] методике, где в качестве антигенов использовали коньюгаты Bp, E2 и Pg с белком-носителем (бычьим сывороточным альбумином). Уровни антител к исследуемым гаптенам выражали в условных единицах (у. е.) [1]. Для каждого обследуемого были рассчитаны индивидуальные соотношения уровней антител двух классов (IgА-Bp/IgА-Pg, IgА-E2/IgА-Pg, IgG-Bp/IgG-Pg, IgG-E2/IgG-Pg).

Концентрацию стероидных гормонов (E2, Pg) определяли с помощью коммерческих наборов «ИммуноФА-Эстрадиол», «ИммуноФА-ПГ» (АО «НВО Иммунотех», Москва, Россия) согласно инструкции по применению.

Все полученные данные были обработаны с помощью ППП Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США). Ненормальный характер распределения качественных признаков определили с помощью W-критерия Шапиро–Уилка и затем для выявления различий между исследуемыми группами использовали U-критерий Манна–Уитни для независимых выборок и непараметрический критерий χ² с поправкой Йейтса на непрерывность вариации. Критический уровень значимости принимался p < 0,05. Средние значения уровней антител и концентрации гормонов представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q_0,25-Q_0,75).

Результаты

Предварительно провели анализ имеющейся выборки больных РМЖ в постменопаузе (n = 1574) по экспрессии в опухоли ER, PR и Ki- 67 в соответствии со стадией процесса (табл. 1). Подтвердили общеизвестные данные о снижении удельного веса больных с ER⁺/PR⁺ опухолями от I к III+IV стадиям (в нашем случае с 77,2% до 62,7%). Соответственно, увеличился удельный вес больных с ER^-/PR^- РМЖ (с 11,4 до 22,5%). При сохранении на одном уровне ER⁺/ PR^- опухолей (11,4-14,8%) различия между больными по удельному весу ER⁺/PR⁺ и ER^-/PR^- в соответствии со стадиями оказались статистически значимыми (р < 0,001).

 

Таблица 1. Число (n) и удельный вес (%) больных раком молочной железы (РМЖ) в зависимости от статуса стероидных рецепторов в опухоли и содержания Ki-67-положительных клеток в опухоли

Table 1. Numbers (n) and prevalence (%) of breast cancer patients (BCP) according to tumor steroid receptors status and levels of tumor Ki-67 positive cells

ER/PR Ki-67	РМЖ I стадии BCP I stage (n = 721)	РМЖ II стадий BCP II stage (n = 6 17)	РМЖ III+IV стадии BCP III+IV stages (n = 236)	χ2 (р) I-II стадии I-II stages	χ2 (р) II-(III+IV) стадии II-(III+IV) stages
	n/%	n/%	n/%
ER+/PR+ ER+/PR- ER-/PR-	557/77,2 82/11,4 82/11,4	413/66,9 81/13,2 123/19,9	148/62,7 35/14,8 53/22,5	21,6 (< 0,001)	1,4 (0,51)
χ2 (р), df = 4	30,7 (< 0,001)
Ki-67 ≤ 20 Ki-67 > 20	400/55,5 321/44,5	229/37,1 388/62,9	73/30,9 163/69,1	44,3 (< 0,001)	2,6 (0,11)
χ2 (р), df = 4	66,4 (< 0,001)

 

Статистически значимые различия проявились в сравнении больных с I и II стадиями РМЖ (р < 0,001) и III+IV стадиями (р < 0,001) по распределению ER⁺/PR⁺, ER⁺/PR^- и ER^-/PR^- опухолей. В аналогичном сравнении больных II и c III+IV стадиями различия практически отсутствовали (р = 0,51). Это позволило в дальнейшем исследовании искомых взаимосвязей индивидуальных уровней антител и гормонов с экспрессией ER и PR объединить больных со II и с III+IV стадиями в одну группу с продолженным ростом опухоли для сравнения с больными в начале злокачественного процесса.

Ожидаемым оказалось и изменение экспрессии Ki-67. Удельный вес больных с низкой пролиферативной активностью (количество в опухоли Ki-67-положительных клеток ≤ 20%) снижался от 55,5% до 30,9% с I к III+IV стадиями. Соответственно, возрастал удельный вес больных с активно пролиферирующими опухолями (Ki- 67 > 20%) с 44,5% до 69,1% (р < 0,001). Так же как и при анализе ER/PR, между больными со II и с III+IV стадиями РМЖ не было различий по распределению больных с Ki-67 ≤ 20% и Ki- 67 > 20% опухолями (р = 0,11). Поэтому их тоже объединили в отдельную группу в дальнейших исследованиях для сравнения с больными с I стадией РМЖ, различия с которыми по этому маркеру были статистически значимыми (р < 0,001).

Рассчитали медианы уровней исследуемых антител и гормонов и их индивидуальных соотношений в сыворотке крови больных РМЖ с I, II и III+IV стадиями (табл. 2). Выяснилось, что их содержание и соотношения сохраняют исходные значения при I стадии ко II и к III+IV. Тенденция к снижению Me соотношения IgA-Bp/IgA-Pg с 1,9 до 1,5 была статистически мало убедительной (р = 0,04), так же как и различия по содержанию E2 (p = 0,03). Проследить индивидуальные изменения уровней исследуемых антител и гормонов у каждой больной от I к III+IV стадии практически невозможно, поскольку они обязательно получают какое-либо лечение, потенциально влияющее на эти показатели.

 

Таблица 2. Медианы (Ме) уровней IgA и IgG антител, специфичных к бензо[a]пирену, эстрадиолу и прогестерону (у. е.), концентраций стероидных гормонов (нмоль/л) и их соотношений у больных раком молочной железы (РМЖ)

Table 2. Median (Me) levels of IgA and IgG antibodies specific to benzo[a]pyrene, estradiol and progesterone (CU), concentrations of steroid hormones (nmol/L) and their ratios in breast cancer patients (BCP)

Антитела, гормоны и их соотношения Antibodies, hormones and their combinations	РМЖ I стадии BCP I stage (n = 721)	РМЖ II стадии BCP II stage (n = 617)	РМЖ III+IV стадий BCP III+IV stages (n = 236)	р I-II стадии I-II stages	р II-(III+IV) стадии II-(III+IV) stages
	Me (Q0,25-Q0,75)	Me (Q0,25-Q0,75)	Me (Q0,25-Q0,75)
1.1. IgA-Bp 1.2. IgA-E2 1.3. IgA-Pg	3,3 (2,1-5,4) 2,7 (1,7-4,1) 1,8 (1,1-2,8)	3,3 (2,0-5,2) 2,7 (1,7-4,2) 1,9 (1,1-3,0)	3,3 (2,2-4,8) 2,7 (1,7-4,0) 2,1 (1,2-3,1)	0,46 0,65 0,31	0,59 0,74 0,56
2.1. IgA-Bp/IgA-Pg 2.2. IgA-E2/IgA-Pg	1,9 (1,3-2,7) 1,5 (1,1-2,0)	1,7 (1,2-2,5) 1,4 (1,1-1,9)	1,5 (1,1-2,2) 1,4 (1,0-1,9)	0,04 0,17	0,04 0,26
3.1. IgG-Bp 3.2. IgG-E2 3.3. IgG-Pg	9,3 (5,8-13,8) 8,1 (5,2-11,7) 4,6 (2,9-7,3)	8,9 (5,1-14,5) 7,6 (4,7-11,6) 4,5 (2,7-7,5)	8,7 (5,2-13,2) 7,3 (4,7-12,0) 4,8 (2,8-7,6)	0,69 0,25 0,95	0,40 0,91 0,91
4.1. IgG-Bp/IgG-Pg 4.2. IgG-E2/IgG-Pg	1,9 (1,4-2,6) 1,7 (1,3-2,2)	1,9 (1,4-2,6) 1,7 (1,3-2,1)	1,8 (1,3-2,4) 1,6 (1,2-2,2)	0,24 0,27	0,19 0,74
5.1. E2 5.2. Pg 5.3. Pg/E2	0,17 (0,10-0,25) 0,72 (0,46-1,15) 4,1 (2,2-8,5)	0,18 (0,11-0,28) 0,74 (0,48-1,12) 3,9 (2,0-8,3)	0,20 (0,13-0,27) 0,75 (0,49-0,99) 3,5 (2,2-8,0)	0,03 0,49 0,18	0,46 0,97 0,45

 

В нашей выборке РМЖ у всех пациенток был выявлен впервые. Поэтому с высокой вероятностью можно утверждать, что содержание исследуемых антител и гормонов в каждом персональном случае не изменяется при прогрессии опухоли, а предполагаемые взаимосвязи иммунологических и эндокринных показателей с потерей опухолью ER и PR и возрастанием пролиферативной активности обусловлены изменениями чувствительности самих трансформированных клеток к росторегулирующим факторам сыворотки крови.

В таблице 3 представлены результаты исследования взаимосвязей содержания в опухоли Ki- 67-положительных клеток с индивидуальными уровнями антител класса А, специфичных к Bp, E2 и Pg, а также с их индивидуальными соотношениями у больных с I и со II-IV стадиями злокачественного процесса. Искомые взаимосвязи не обнаружены у больных с I стадией. Удельный вес больных с активно пролиферирующими опухолями (Ki-67 > 20%) был ниже, чем с низко пролиферирующими опухолями (Ki-67 ≤ 20%) независимо от уровней каждого из исследуемых антител и их индивидуальных соотношений (р = 0,17-0,84).

 

Таблица 3. Число (n) и удельный вес (%) больных раком молочной железы (РМЖ) с различным содержанием Ki-67-положительных клеток в опухоли в зависимости от уровней антител, специфичных к бензо[a]пирену, эстрадиолу и прогестерону (у. е.), и их соотношений

Table 3. Numbers (n) and prevalence (%) of breast cancer patients (BCP) with different levels of tumor Ki-67 positive cells according to serum levels of antibodies, specific to benzo[a]pyrene, estradiol and progesterone (CU), and their ratios

Антитела и их соотношения Antibodies and their combinations	РМЖ I стадии BCP I stage (n = 721)		РМЖ II-IV стадий BCP II-IV stages (n = 853)		Δ% Ki-67 > 20% (р)
	Ki-67 ≤ 20%	Ki-67 > 20%	Ki-67 ≤ 20%	Ki-67 > 20%
1.1. IgA-Bp < 2 1.2. IgA-Bp 2-4 1.3. IgA-Bp > 4	88/55,7 158/57,0 154/53,8	70/44,1 119/43,0 132/46,2	76/37,4 122/36,4 104/33,0	127/62,6 213/63,6 211/67,0	18,5 (< 0,001) 20,6 (< 0,001) 20,8 (< 0,001)
χ2 (р), df = 2	0,6 (0,75)		1,3 (0,52)
2.1. IgA-E2 < 2 2.2. IgA-E2 2-4 2.3. IgA-E2 > 4	150/58,4 144/52,6 106/55,8	107/41,6 130/47,4 84/44,2	100/37,2 132/36,8 70/31,3	169/62,8 227/63,2 155/68,9	21,2 (< 0,001) 15,8 (< 0,001) 24,7 (< 0,001)
χ2 (р), df = 2	1,8 (0,40)		2,5 (0,29)
3.1. IgA-Pg < 1 3.2. IgA-Pg 1-2 3.3. IgA-Pg > 2	83/57,6 145/55,1 172/54,8	61/42,4 118/44,9 142/45,2	51/30,2 113/40,4 138/34,2	118/69,8 167/59,6 266/65,8	27,4 (< 0,001) 14,7 (< 0,001) 20,6 (< 0,001)
χ2 (р), df = 2	0,3 (0,84)		5,3 (0,07)
4.1. IgA-Bp/IgA-Pg < 1 4.2. IgA-Bp/IgA-Pg 1-2 4.3. IgA-Bp/IgA-Pg > 2	58/56,3 154/51,7 188/58,8	45/43,7 144/48,3 132/41,2	65/43,9 122/31,7 115/35,9	83/56,1 263/68,3 205/64,1	12,4 (0,07) 20,0 (< 0,001) 22,9 (< 0,001)
χ2 (р), df = 2	3,2 (0,21)		7,1 (0,03)
5.1. IgA-E2/IgA-Pg < 1 5.2. IgA-E2/IgA-Pg 1-2 5.3. IgA-E2/IgA-Pg > 2	88/60,3 203/52,3 109/58,3	58/39,7 185/47,7 78/41,7	70/37,8 173/36,0 59/31,4	115/62,2 307/64,0 129/68,6	22,5 (< 0,001) 16,3 (< 0,001) 26,9 (< 0,001)
χ2 (р), df = 2	3,5 (0,17)		1,9 (0,39)

 

У больных на II-IV стадиях РМЖ активно пролиферирующие опухоли обнаруживали чаще, чем низко пролиферирующие, независимо от содержания в сыворотке крови исследуемых IgA-Bp, IgA-E2 и IgA-Pg, так же как и от IgA-E2/IgA-Pg (p = 0,07-0,52). Тенденция к возрастанию удельного веса больных с активно пролиферирующими опухолями с 56,1% до 68,3% и 64,8% проявилось только при возрастании индивидуальных соотношений IgA-Bp/IgA-Pg (р = 0,03).

При сравнении больных с I и II-IV стадиями РМЖ увеличение удельного веса активно пролиферирующих опухолей имело место независимо от уровней исследуемых антител и соотношения IgA-E2 /IgA-Pg (р < 0,001). Статистически незначимая разница в этом сравнении обнаружена только у больных с низким значением индивидуального соотношения IgA-Bp/IgA-Pg (с 43,7% до 56,1%, р = 0,07).

Исследование ER и PR положительных опухолей больных с I и II-IV стадиями РМЖ в зависимости от содержания в сыворотке IgA-Bp, IgA-E2 и IgA-Pg показало следующее (табл. 4). У больных с I стадией удельный вес ER⁺/PR⁺ опухолей был меньше, а ER^-/PR^- опухолей больше при низких уровнях IgA-Bp < 2 (72,8% и 12,7%), чем при высоких уровнях IgA-Bp > 4 (83,2% и 7,7% соответственно, р = 0,03). Искомые взаимосвязи с IgA-E2 и IgA-Pg не обнаружены (p = 0,43 и р = 0,78). В аналогичном сравнении с учетом IgA-Bp/IgA-Pg также различия оказались статистически более значимыми (63,1% и 17,5% при IgA-Bp/IgA-Pg < 1 против 84,1% и 7,2% при IgA-Bp/IgA-Pg > 2 соответственно, р < 0,001). Менее выраженной была разница по IgA-E2/IgA-Pg (68,5% и 17,8% против 82,8% и 8,6% соответственно, р = 0,02).

 

Таблица 4. Число (n) и удельный вес (%) больных раком молочной железы (РМЖ) с различным рецепторным статусом опухоли в зависимости от уровней антител, специфичных к бензо[a]пирену, эстрадиолу и прогестерону (у. е.), и их соотношений

Table 4. Numbers (n) and prevalence (%) of breast cancer patients (BCP) with different tumor steroid receptors status according to serum levels of antibodies, specific to benzo[a]pyrene, estradiol and progesterone (CU), and their ratios

Антитела и их соотношения Antibodies and their combinations	РМЖ I стадии BCP I stage (n = 721)			РМЖ II-IV стадий BCP II-IV stages (n = 853)			Δ% ER-/PR- (р)
	ER+/PR+	ER+/PR-	ER-/PR-	ER+/PR+	ER+/PR-	ER-/PR-
	n/%	n/%	n/%	n/%	n/%	n/%
1.1. IgA-Bp < 2 1.2. IgA-Bp 2-4 1.3. IgA-Bp > 4	115/72,8 204/73,6 238/83,2	231/14,6 33/11,9 26/9,1	20/12,7 40/14,4 22/7,7	124/61,1 218/65,1 219/69,5	28/13,8 50/14,9 38/12,1	51/25,1 67/20,0 58/18,4	12,4 (0,01) 5,6 (0,07) 10,7 (< 0,001)
χ2 (р), df = 4	10,9 (0,03)			5,2 (0,27)
2.1. IgA-E2 < 2 2.2. IgA-E2 2-4 2.3. IgA-E2 > 4	189/73,5 216/78,8 152/80,0	32/12,5 29/10,6 21/11,1	36/14,0 29/10,6 17/8,9	166/61,7 238/66,3 157/68,8	42/15,6 49/13,6 25/11,1	61/22,7 72/20,1 43/19,1	8,7 (0,01) 9,5 (0,002) 10,2 (0,01)
χ2 (р), df = 4	3,9 (0,43)			3,9 (0,42)
3.1. IgA-Pg < 1 3.2. IgA-Pg 1-2 3.3. IgA-Pg > 2	115/79,9 201/76,4 241/76,8	17/11,8 29/11,0 36/11,5	12/8,3 33/12,5 37/11,8	96/56,8 193/68,9 272/67,3	25/14,8 35/12,5 56/13,9	48/28,4 52/18,6 76/18,8	20,1 (< 0,001) 6,1 (0,11) 7,0 (0,02)
χ2 (р), df = 4	1,7 (0,78)			9,3 (0,06)
4.1. IgA-Bp/IgA-Pg < 1 4.2. IgA-Bp/IgA-Pg 1-2 4.3. IgA-Bp/IgA-Pg > 2	65/63,1 223/74,8 269/84,1	20/19,4 34/11,4 28/8,8	18/17,5 41/13,8 23/7,2	94/63,5 250/64,9 217/67,8	21/14,2 60/15,6 35/10,9	33/22,3 75/19,5 68/21,3	4,8 (0,43) 5,7 (0,02) 14,1 (< 0,001)
χ2 (р), df = 4	22,4 (< 0,001)			3,7 (0,45)
5.1. IgA-E2/IgA-Pg < 1 5.2. IgA-E2/IgA-Pg 1-2 5.3. IgA-E2/IgA-Pg > 2	100/68,5 302/77,8 155/82,8	20/13,7 46/11,9 16/8,6	26/17,8 40/10,3 16/8,6	126/68,1 314/65,4 121/64,4	26/14,1 69/14,4 21/11,2	33/17,8 97/20,2 46/24,5	0 (0,99) 9,9 (< 0,001) 15,9 (< 0,001)
χ2 (р), df = 4	11,3 (0,02)			3,4 (0,50)

 

У больных со II-IV стадиями РМЖ ER⁺/PR⁺, ER⁺/PR^- и ER^-/PR^- опухоли обнаруживали с одинаковой частотой при любом значении их индивидуальных соотношений.

При сравнении больных с I стадией и со II-IV стадиями РМЖ ожидаемого снижения удельного веса ER⁺/PR⁺ опухолей и соответствующего повышения удельного веса ER^-/PR^- опухолей не обнаружено при средних значениях уровней IgA- Bp 2-4 (р = 0,07) и IgA-Pg 1-2 (р = 0,11); при низких показателях соотношений IgA-Bp/IgA-Pg < 1 (р = 0,43) и IgA-E2/IgA-Pg < 1 (р = 0,99).

Предполагаемые взаимосвязи уровней IgG-Bp, IgG-E2 и IgG-Pg, равно как и индивидуальных соотношений IgG-Bp/IgG-Pg и IgG-E2/IgG-Pg с экспрессией в опухоли ER, PR и Ki-67 не обнаружены у больных РМЖ ни при I, ни при II-IV стадиях по-отдельности, ни при сравнении больных с I и со II-IV стадиями (полученные результанты не представлены в таблицах).

Выборочные исследования взаимосвязей иммуногистохимических маркеров опухоли с содержанием в сыворотке стероидных гормонов у больных РМЖ с I стадией (n = 555) и со II-IV стадиями (n = 610) показали следующее. Удельный вес больных с активно пролиферирующими опухолями (табл. 5) при I стадии оказался выше при высоких концентрациях Pg > 800 пмоль/л, чем при низких Pg < 400 пмоль/л (49,6% против 29,7%, р = 0,003). Не обнаружено ассоциаций экспрессии Ki-67 с содержанием E2 и индивидуальных соотношений Pg/E2 у больных с I стадией РМЖ. У больных со II-IV стадиями небольшая разница по уровням Ki-67 > 20% проявилась при анализе соотношений Pg/E2 (р = 0,04).

 

Таблица 5. Число (n) и удельный вес (%) больных раком молочной железы (РМЖ) с различным содержанием Ki-67 положительных клеток в опухоли в зависимости от концентрации стероидных гормонов (пмоль/л) и их соотношений

Table 5. Numbers (n) and prevalence (%) of breast cancer patients (BCP) with different levels of tumor Ki-67 positive cells according to steroids hormones concentrations (pmol/L) and their ratios

Гормоны и их соотношения Hormones and their combinations	РМЖ I стадии BCP I stage (n = 555)		РМЖ II-IV стадий BCP II-IV stages (n = 610)		Δ% Ki-67 > 20% (р)
	Ki-67 ≤ 20%	Ki-67 > 20%	Ki-67 ≤ 20%	Ki-67 > 20%
1.1. E2 < 100 1.2. E2 100-200 1.3. E2 > 200	78/56,5 125/62,5 111/51,2	60/43,5 75/37,5 106/48,8	59/46,1 73/36,7 98/34,6	69/53,9 126/63,3 185/65,4	10,4 (0,11) 25,8 (< 0,001) 16,6 (< 0,001)
χ2 (р), df = 2	5,5 (0,07)		5,1 (0,08)
2.1. Pg < 400 2.2. Pg 400-800 2.3. Pg > 800	78/70,3 113/56,5 123/50,4	33/29,7 87/43,5 121/49,6	48/43,6 77/32,9 105/39,5	62/56,4 157/67,1 161/60,5	26,7 (< 0,001) 23,6 (< 0,001) 10,9 (0,02)
χ2 (р), df = 2	12,3 (0,003)		4,3 (0,12)
3.1. Pg/E2 < 3 3.2. Pg/E2 3-6 3.3. Pg/E2 > 6	126/62,4 77/52,0 111/54,1	76/37,6 71/48,0 94/45,9	92/37,2 53/31,2 85/44,0	155/62,8 117/68,8 108/56,0	25,2 (< 0,001) 20,8 (< 0,001) 10,1 (0,06)
χ2 (р), df = 2	4,5 (0,11)		6,4 (0,04)

 

Незначительное возрастание частоты пролиферирующих опухолей (Ki-67 > 20,0%) у больных со II-IV стадиями по сравнению с I стадией было характерно для пациенток с низким содержанием в сыворотке E2 < 100 пмоль/л (53,9% против 43,5%, р = 0,11) и с высоким значением индивидуального соотношения Pg/E2 > 6 (56,0% против 45,9%, р = 0,06). Во всех остальных позициях таковое возрастание было значительно больше и статистически достоверным (р < 0,001).

Содержание в опухоли гормональных рецепторов (табл. 6) оказалось взаимосвязанным с концентрацией в сыворотке Pg. ER⁺/PR⁺ опухоли у больных с I стадией и средними значениями Pg 400-800 пмоль/л встречались реже (72,0%), чем у больных с низкими и высокими значениями Pg (82,0% и 84,0%, р = 0,007). Аналогичные различия обнаружены и у больных II-IV стадиями (62,8% против 76,4% и 70,8% соответственно, р = 0,03).

 

Таблица 6. Число (n) и удельный вес (%) больных раком молочной железы (РМЖ) с различным рецепторным статусом опухоли в зависимости от концентрации стероидных гормонов (пмоль/л) и их соотношений

Table 6. Numbers (n) and prevalence (%) of breast cancer patients (BCP) with different tumor steroid receptors status according to steroids hormones concentrations (pmol/L) and their ratios

Гормоны и их соотношения Hormones and their combinations	РМЖ I стадия BCP I stage (n = 555)			РМЖ II-IV стадии BCP II-IV stages (n = 610)			Δ%ER-/PR- (р)
	ER+/PR+	ER+/PR-	ER-/PR-	ER+/PR+	ER+/PR-	ER-/PR-
	n/%	n/%	n/%	n/%	n/%	n/%
1.1. E2 < 100 1.2. E2 100-200 1.3. E2 > 200	113/81,9 159/79,5 168/77,4	12/8,7 26/13,0 25/11,5	13/9,4 15/7,5 24/11,1	91/71,1 140/70,4 188/66,4	10/7,8 26/13,1 37/13,1	27/21,1 33/16,6 58/20,5	11,7 (0,03) 9,1 (0,02) 9,4 (0,01)
χ2 (р), df = 4	2,9 (0,56)			3,9 (0,42)
2.1. Pg < 400 2.2. Pg 400-800 2.3. Pg > 800	91/82,0 144/72,0 205/84,0	14/12,6 26/13,0 23/9,4	6/5,4 30/15,0 16/6,6	84/76,4 147/62,8 188/70,7	13/11,8 27/11,5 33/12,4	13/11,8 60/25,6 45/16,9	6,4 (0,24) 10,6 (0,03) 10,3 (< 0,001)
χ2 (р), df = 4	14,2 (0,007)			11,2 (0,03)
3.1. Pg/E2 < 3 3.2. Pg/E2 3-6 3.3. Pg/E2 > 6	153/75,7 114/77,0 173/84,4	28/13,9 20/13,5 15/7,3	21/10,4 14/9,5 17/8,3	174/70,4 108/63,5 137/71,0	31/12,6 21/12,4 21/10,9	42/17,0 41/24,1 35/18,1	6,6 (0,13) 14,6 (0,003) 9,8 (0,004)
χ2 (р), df = 4	6,2 (0,18)			4,0 (0,40)

 

Незначительное возрастание удельного веса больных с ER^-/PR^- опухолями при II-IV стадиях по сравнению с I стадией наблюдалось в случаях с низкими уровнями Pg в сыворотке (11,8% против 5,4%, р = 0,2) и с низкими индивидуальными соотношениями Pg/E2 < 3 (17,0% против 10,4%, р = 0,13). Таковое возрастание было более выраженным и статистически достоверным у больных: при любом содержании в сыворотке E2; при уровнях Pg ≥ 400 пмоль/л; при соотношениях Pg/ E2 ≥ 3.

Обсуждение

Исследовали взаимосвязь между количеством опухолевых клеток, экспрессирующих Ki-67, ER и PR, и уровнем антител классов A и G к Bp, E2 и Pg, а также E2 и Pg в сыворотке крови у больных РМЖ. Диагноз РМЖ на стадиях I, II и III+IV у всех больных был выявлен впервые и до этого они не получали никакого противоопухолевого лечения. Это послужило основанием условно интерпретировать различия между больными на стадиях I-III+IV как индивидуальные изменения экспрессии опухолевых маркеров во взаимосвязи с уровнями исследуемых гормонов и антител и таким образом определить предикторную роль последних в прогрессии РМЖ.

Как и ожидалось, при II и III+IV стадиях статистически значимо снижалось количество случаев с ER⁺/PR⁺ опухолями с низким содержанием Ki-67-положительных клеток (≤ 20,0%) и соответственно возрастало количество случаев с ER^-/PR^- опухолями с высоким содержанием Ki-67 (> 20,0%) по сравнению с I стадией. Это подтвердило известные представления об утрате стероидных рецепторов и росте пролиферативной активности опухоли при прогрессии РМЖ. Отсутствие сколько-нибудь значимых различий по этим показателям между больными со II и III+IV стадиями позволило объединить их в общую группу в дальнейших поисках искомых взаимосвязей с исследуемыми антителами и гормонами.

По содержанию в сыворотке крови всех исследуемых антител и гормонов больных РМЖ с I, II и III+IV стадиями не имели различий. Отмечено только слабая и статистически мало значимая тенденция к возрастанию количества E2 и снижения показателя соотношения IgA-Bp/IgA-Pg. Это свидетельствовало о том, что прогрессия РМЖ с утратой стероидных рецепторов и возрастанием пролиферативной активности опухоли происходит на фоне неизменных уровней и антител, и гормонов.

Вместе с тем обнаружены явные различия в экспрессии молекулярно-биологических маркеров опухоли при прогрессии РМЖ у больных с различными уровнями исследованных гормонов и антител.

У больных с низкими концентрациями E2 в сыворотке крови (< 100 пмоль/л) количество Ki- 67-положительных клеток в опухоли от I ко II-IV стадиям возросло на 10,4% (статистически незначимо). При больших концентрациях E2 таковое возрастание составило 16,6-25,8% и было статистически высоко достоверным. Это подтверждает известные представления о стимулирующем пролиферацию опухоли действии E2. При этом удельный вес больных с ER^-/PR^- опухолями возрастал значимо независимо от содержания в сыворотке E2.

Количество больных с активно пролиферирующими опухолями (Ki-67 > 20,0%) возрастало от I ко II-IV стадиям независимо от концентрации Pg. При этом у больных с низкими концентрациями Pg (< 400 пмоль/л) возрастание удельного веса ER^-/PR^- опухолей на 6,4% было статистически незначимыми, а при больших концентрациях – на 10,3-10,6% статистически достоверными.

У больных с высокими значениями индивидуальных соотношений Pg/E2 > 6 удельный вес опухолей с Ki-67 > 20% возрастал недостоверно на 10,1%, а при меньших значениях этого соотношения – на 20,8-25,2% с высокой статистической значимостью. Напротив, количество ER^-/ PR^- опухолей увеличивалось малозначимо на 6,6% у больных с низкими значениями Pg/E2 < 3, а у больных Pg/E2 ≥ 3 – на 9,8-14,6% статистически достоверно.

Таким образом, торможение утраты опухолью ER при прогрессии РМЖ было ассоциировано с низким содержанием Pg в сыворотке, в том числе в соотношении с содержанием E2, а торможение пролиферативной активности опухоли оказалось взаимосвязанным с высокими индивидуальными соотношениями Pg/E2, что подтверждает результаты экспериментов по торможению роста эксплантов ER⁺ РМЖ под действием Pg [15].

При анализе исследуемых антител класса А статистически незначимое увеличение количества больных с активно пролиферирующими опухолями (Ki-67 > 20,0%) от I ко II-IV стадиям на 12,4% имело место только в случаях с низкими значениями индивидуальных соотношений IgA- Bp/IgA-Pg < 1. При высоких IgA-Bp/IgA- Pg ≥ 1 – в 20-22,9% случаев и было статистически высоко значимым. При любых других уровнях IgA-Bp, IgA-E2 и IgA-Pg, а также при любых соотношениях IgA-E2/IgA-Pg рост удельного веса больных с Ki-67 > 20% опухолями был статистически достоверным от 14,7% до 26,9%.

Торможение утраты опухолью ER в процессе роста наблюдалось у больных со средними значениями уровней IgA-Pg (2-4 у. е.) – на 5,6%, средними значениями уровней IgA-Pg (1-2 у. е.) – на 6,1% и низкими соотношениями IgA-Bp/IgA-Pg (< 1) – на 4,8%. При низких показателях соотношения IgA-E2/IgA-Pg (< 1) такового роста вообще не проявлялось (0%). Во всех остальных случаях возрастание удельного веса больных с ER^-/ PR^- опухолях при II-IV стадиях по сравнению с I было более значительным и статистически достоверным.

Таким образом, как и при анализе гормонов взаимосвязи исследуемых антител класса А с изменениями рецепторного статуса и пролиферативной активностью опухоли проявлялись по-разному. Например, у больных с низкими значениями Pg/E2 < 3 возрастание удельного веса ER^-/PR^- опухолей составляло всего 6,6%, (р = 0,13), а возрастание Ki-67 > 20% опухолей составляло 25,2% (р < 0,001). У больных с низкими значениями IgA-E2/IgA-Pg < 1 количество ER^-/ PR^- опухолей вообще не изменялось, а количество опухолей с Ki-67 > 20% возрастало на 22,5% (р < 0,001). В настоящей когорте больных (без учета иммунологических и эндокринных показателей) пролиферативная активность была взаимосвязана с рецепторным статусом: при ER^-/ PR^- опухоли с Ki-67 ≤ 20% встречались в 6,2%, а опухоли с Ki-67 > 20% – в 24,5% (р < 0,001). То есть активная пролиферация опухоли происходила одновременно с утратой стероидных рецепторов. Почему при некоторых значениях содержания гормонов или антител сохранялась экспрессия ER при прогрессии опухоли, а пролиферативная активность значительно возрастала, остается непонятным и требует дальнейшего изучения.

Остается непонятным и отсутствие искомых взаимосвязей между экспрессией ER, PR и Ki- 67 и исследованных антител класса G. Ранее у крыс, иммунизированных против E2, обнаруживали торможение появления и роста трансплантированной аденокарциномы молочной железы, по мнению авторов, за счет связывания E2-специфичными антителами [9]. Если антитела против стероидных гормонов связывают их в сыворотке крови и ограничивают их поступление в опухолевые клетки-мишени, то влияние специфичных IgG на поведение опухоли должно проявляться каким-либо образом аналогично выявленному в настоящей работе влиянию специфичных IgА. Однако этого не было обнаружено. Вероятно, IgА не только связывают соответствующий гормон, но и способствует его проникновению в эпителиальные клетки-мишени в виде комплекса гаптен-антитело за счет мембранных Fс-рецепторов для IgА. Внутри клетки комплекс распадается и гормон осуществляет свои биологические функции вместе с таким же гормоном, поступающим в клетку трансмембранно будучи гидрофобным.

Например, у больных РМЖ с индивидуальными соотношениями IgA-E2/IgA-Pg < 1 превалирование антител, связывающих Pg, над антителами, связывающими E2, способствует преимущественному транспорту в цитоплазму клеток комплексов IgA-Pg с Pg, но не IgA-E2 с E2. В результате «избыток» высвободившегося из комплексов Pg при «недостатке» E2 тормозит «утрату» клеток и E2, и PR при прогрессии опухоли, как показано в таблице 4. Однако такого дополнительного, иммунологического механизма воздействия на опухолевые клетки-мишени оказывается недостаточным, чтобы ингибировать их пролиферативную активность. Гипотетический характер такого объяснения полученных результатов подразумевает необходимость проведения дальнейших исследований иммунологических механизмов регуляции прогрессии РМЖ и других гормонозависимых опухолей.

Обнаруженные взаимосвязи экспрессии молекулярно-биологических маркеров (ER, PR и Ki-67) с содержанием в сыворотке крови антител против Bp, E2 и Pg позволят определить предикторное значение последних в оценке персональных особенностей прогрессии РМЖ: утрате стероидных рецепторов и/или повышения пролиферативной активности опухоли.

Благодарности

Авторы благодарят академика Л.И. Иванову за поддержку выбранного направления исследований, а также сотрудников лаборатории иммунохимии Института экологии человека ФИЦ УУХ СО РАН Т.П. Аносову, М.П. Аносова, Е.А. Гурова за техническую поддержку настоящей работы.

About the authors

A. N. Glushkov

Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: egpolenok@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Chief Researcher, Laboratory of Immunogenetics

Russian Federation, Kemerovo

Elena G. Polenok

Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: egpolenok@mail.ru

PhD (Pharmacy), Leading Researcher, Laboratory of Immunochemistry

Russian Federation, Kemerovo

L. A. Gordeeva

Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: egpolenok@mail.ru

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Immunogenetics

Russian Federation, Kemerovo

M. V. Kostyanko

Kemerovo State University

Email: egpolenok@mail.ru

Leading Engineer, Department of Organic Chemistry

Russian Federation, Kemerovo

V. N. Zakharov

Kuzbass Clinical Oncology Dispensary

Email: egpolenok@mail.ru

PhD (Medicine), Chief Physician

Russian Federation, Kemerovo

A. V. Antonov

Kuzbass Clinical Oncology Dispensary

Email: egpolenok@mail.ru

Head, Breast Cancer Department

Russian Federation, Kemerovo

P. V. Bayramov

Kuzbass Clinical Oncology Dispensary

Email: egpolenok@mail.ru

Head, Department of Pathology

Russian Federation, Kemerovo

N. E. Verzhbitskaya

Kuzbass Clinical Oncology Dispensary

Email: egpolenok@mail.ru

PhD (Medicine), Pathologist, Department of Pathology

Russian Federation, Kemerovo

G. I. Kolpinskiy

Kemerovo State Medical University; I. Kolpinsky Clinical Consultative and Diagnostic Center

Email: egpolenok@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Department of Radiology, Radiotherapy and Oncology, Chief Physician

Russian Federation, Kemerovo; Kemerovo

References

Supplementary files