Effects of polyamines of bacterial origin on IgG production in patients with maxillofacial phlegmona

Full Text

Введение

Среди бактериальных метаболитов, оказывающих влияние на функциональную активность иммунокомпетентных клеток, интерес представляют кадаверин и путресцин, поскольку обладают широким спектром биологической активности и могут оказывать на лейкоциты рецептор-независимое действие [7, 10]. В экспериментальных исследованиях на лейкоцитах практически здоровых доноров установлено, что кадаверин снижает их фагоцитарную активность, а также меняет соотношение типов фагоцитирующих клеток [3, 12]. В первую очередь уменьшается число фагоцитирующих нейтрофилов [3, 14]. Кроме этого, показано, что кадаверин стимулирует способность лейкоцитов к продукции гидроксильных радикалов, а путресцин слабо влияет на радикал-продуцирующую активность этих клеток [4, 14]. В исследованиях in vitro установлено, что кадаверин снижает способность лейкоцитов к продукции интерферона-гамма [13]. В свою очередь, путресцин оказывает аналогичный эффект только при малых концентрациях. При высоком уровне полиаминов бактериального происхождения увеличивается синтез лейкоцитами IL-4 [2].

Известно, что функциональная активность лейкоцитов существенно меняется при развитии воспаления, происходит перестройка метаболизма и синтетических механизмов клеток [1, 9]. Именно поэтому представляет интерес изучение влияния полиаминов как на клетки здоровых доноров, так и на лейкоциты пациентов с воспалительными заболеваниями.

Для развития и последующего разрешения воспалительного процесса важно участие иммуноглобулинов, оказывающих опсонизирующее действие на микроорганизмы, облегчающее их элиминацию. Среди таких иммуноглобулинов наибольшей активностью отличаются иммуноглобулины G (IgG), являющиеся основным классом антител, которые играют ключевую роль в иммунной системе, обеспечивая защиту от бактериальных и вирусных агентов [11]. Однако в настоящее время относительно мало исследований, изучающих влияние полиаминов на функциональную активность плазматических клеток. Понимание этих механизмов позволит расширить текущие представления о взаимодействие про- и эукариотических клеток в септическом очаге и открыть новые горизонты противовоспалительной терапии.

Цель – оценить влияние кадаверина и путресцина на продукцию иммуноглобулина G в культуре мононуклеарных лейкоцитов пациентов с флегмоной челюстно-лицевой области (ЧЛО).

Материалы и методы

Объектами изучения служили лейкоциты периферической венозной крови, полученной от 13 пациентов с флегмоной лица (средний возраст 47,0±1,7 года) и 10 практически здоровых доноров (средний возраст 45,3±1,5 года), которые дали добровольное согласие на использование образцов крови (протокол ЛЭК № 5 от 24.05.2023). Критериями включения были мужской пол, возраст от 18 до 30 лет, наличие флегмоны 2-3 клетчаточных пространств, подтвержденной инструментально и клинически, отсутствие хронических заболеваний в стадии обострения, иммунодефицитных состояний.

Лейкоциты получали путем градиентного центрифугирования гепаринизированной крови с использованием смеси фиколл-верографин с плотностью 1,078 г/см³. После сбора интерфазной части клеточную взвесь перемешивали и трижды отмывали. Для культивирования лимфоцитов использовали микрометод и пластиковые круглодонные 96-луночные планшеты. Каждая культура содержала 2 × 10⁵ клеток в 0,2 мл полной культуральной среды. Последнюю готовили ex tempore на основе среды 199 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N’-2-этансульфоновая кислота), 100 мкг/мл гентамицина сульфата и 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки. В качестве В-клеточного стимулятора использовали митоген лаконоса PWM (2,5 мкг/мл). Кадаверин и путресцин использовали в конечных концентрациях 5, 25, 50, 75 и 100 ммоль/л. В качестве контроля использовали пробы, куда вместо полиаминов вносили культуральную среду. Культивирование выполнялось во влажной атмосфере с 5% СО₂ при 37 °С в течение 72 ч. По окончании срока инкубации культуральную жидкость стягивали и замораживали. Концентрации иммуноглобулинов G определяли с помощью иммуноферментного метода набором реагентов производства АО «Вектор-Бест» (Россия).

Статистический анализ проводился с помощью программного пакета Statistica 6.0. Вычислялась средняя арифметическая величина (М) и стандартная ошибка средней арифметической (m). Для проверки нормальности распределения использовали критерий Шапиро–Уилка. В случае распределения, приближенного к нормальному, использовали критерий Стьюдента, в остальных – критерий Манна–Уитни для оценки значимости различий.

Результаты и обсуждение

Как показано нами ранее, увеличение концентрации путресцина коррелирует с уменьшением общего числа клеток (r = -0,75). Число нежизнеспособных клеток статистически значимо не отличалось от аналогичного показателя в контрольных пробах. В пробах с концентрациями кадаверина 5 ммоль/л и 25 ммоль/л общее число клеток увеличилось до 3014±1312 и 4000±1292 в 1 мкл соответственно, против 1990±1036 в 1 мкл в контрольных пробах (p = 0,036). Однако в пробах с большим содержанием кадаверина повышения общего количества лейкоцитов не зарегистрировано. Кроме этого, отмечена тенденция к снижению числа нежизнеспособных клеток до 28±12 при 25 ммоль/л и 80±47 в 1 мкл при 5 ммоль/л кадаверина (425±169 в 1 мкл в контрольных образцах; p = 0,041 и p = 0,029 соответственно).

В отсутствие полиаминов выявлена более высокая продукция IgG мононуклеарами пациентов с острым гнойным процессом ЧЛО (27,6±2,2 МЕ на 1 г белка) по сравнению со здоровыми донорами (13,6±1,5 МЕ на 1 г белка; p = 0,002). При этом в контрольной группе корреляционная связь уровня полиаминов и продукции IgG была положительная (путресцин r = 0,98; кадаверин r = 0,92). Изменение направленности корреляционной связи у пациентов с острым воспалительным процессом (путресцин r = -0,93; кадаверин r = -0,50) косвенно указывает на истощение синтетического аппарата лимфоцитов. Можно предположить, что пул иммуноглобулина G исчерпан за период от начала заболевания до обращения за медицинской помощью. Как установлено ранее, пациенты с таким заболеванием обращаются за медицинской помощью, спустя, как правило, более 70 ч [5].

При культивировании лимфоцитов крови пациентов с флегмоной ЧЛО в присутствии полиаминов установлено, что кадаверин во всех изученных концентрациях статистически значимо не менял продукцию IgG в культуре мононуклеаров (рис. 1). Однако выявлена обратная зависимость между концентрацией кадаверина и уровнем иммуноглобулинов G (r = -0,50). При использовании путресцина установлено, что этот метаболит в культуре мононуклеаров дозозависимо снижает продукцию ими IgG (r = -0,93).

 

Рисунок 1. Изменение продукции иммуноглобулинов класса G в культуре мононуклеарных лейкоцитов в присутствии путресцина (А) и кадаверина (Б)

Примечание. По оси абсцисс – концентрация полиаминов в культуральной среде, ммоль/л; по оси ординат – концентрация IgG, МЕ на 1 мг белка.

Figure 1. Changes in the production of immunoglobulins G in a culture of mononuclear leukocytes in the presence of putrescine (A) and cadaverine (B)

Note. The abscissa axis shows the concentration of polyamines in the culture medium, mmol/l; the ordinate axis shows the concentration of IgG, IU per 1 mg of protein.

 

Отмечено, что уровень продукции IgG в культуре мононуклеаров пациентов с флегмоной лица существенно выше, чем клетками практически здоровых доноров даже в присутствии полиаминов (рис. 1).

В целом для полиаминов характерно проявление их стимулирующей активности на продукцию IgG после предварительной активации клеток воспалительными стимулами, что наиболее выраженно проявляется при малых концентрациях этих метаболитов (5 ммоль/л и 25 ммоль/л). При повышении концентрации путресцина до 100 ммоль/л выявлено снижение продукции IgG (16,4±1,1 МЕ на 1 мг белка) по сравнению с аналогичным показателем у практически здоровых доноров (20,6±1,1 МЕ на 1 мг белка; p = 0,046).

Заключение

Таким образом, изменение продукции иммуноглобулинов класса G лимфоцитами под влиянием полиаминов бактериального происхождения указывает, что эти соединения проявляют свои свойства после предварительного или одновременного влияния разных воспалительных стимулов на лейкоциты. Согласно биологическим свойствам полиаминов, можно предположить, что повышение их концентрации целесообразно для выживания микроорганизмов, поскольку, являясь скавенджерами свободных радикалов, путресцин в большей степени гасит «респираторный взрыв», наблюдаемый при остром воспалении [6, 8]. С другой стороны, стимуляция продукции IgG под влиянием кадаверина может обеспечить дальнейшую опсонизацию и облегчение фагоцитоза микроорганизмов. Однако, как показано нами ранее [3], те же полиамины снижают фагоцитарную активность лейкоцитов, в том числе путем снижения такой активности нейтрофилов в первую очередь.

About the authors

I. A. Morozov

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: AGodovalov@gmail.com

Postgraduate Student, Department of Microbiology and Virology

Russian Federation, Perm

Anatoliy P. Godovalov

E.A. Vagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: AGodovalov@gmail.com

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Microbiology and Virology; Leading Researcher, Central Scientific Laboratory

Russian Federation, Perm

I. A. Boev

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: AGodovalov@gmail.com

Attending Researcher, Department of Surgical Dentistry

Russian Federation, Perm

M. А Boeva

Family Stomatology “Dr Boeva” LLC

Email: AGodovalov@gmail.com

Chief Doctor

Russian Federation, Perm

References

Supplementary files