Interaction of steroid hormones and hormone-specific autoantibodies in regulation of tumor proliferative activity in breast cancer patients

Full Text

Работа выполнена в рамках государственного задания (проект FWEZ-2026-0004).

Введение

Разработка и внедрение новых методов диагностики молекулярно-биологических подтипов рака молочной железы (РМЖ) позволяет оптимизировать имеющиеся схемы лечения с учетом индивидуальных особенностей опухоли у конкретных больных [4]. Продолжается поиск циркулирующих биологических маркеров прогрессии РМЖ, модулирующих пролиферативную активность опухоли, ее метастазирование и вероятность рецидива. В частности, обнаружено влияние некоторых цитокинов на содержание в опухоли маркера клеточной пролиферации, протеина Ki-67, и на метастазирование РМЖ [1, 5, 19]. Меньшее внимание уделяется аутоантителам портив стероидных гормонов и их клеточных рецепторов, потенциально способных модулировать гормонозависимый канцерогенез.

В результате многочисленных экспериментов убедительно доказано, что иммунизация животных против эстрадиола и прогестерона (E2 и Pg) сопровождалась повышением концентрации этих гормонов в сыворотке крови [7, 16, 32]. При иммунизации крыс против E2 наблюдали торможение роста E2-зависимой опухоли при ее трансплантации, по мнению авторов, за счет связывания E2 гаптен-специфическими антителами [9]. Антитела против рецепторов E2 и Pg (ER и PR) проявляли внегеномные эффекты на культивируемые in vitro клетки опухоли молочной железы [8, 12, 37], так же как и антиидиотипические антитела, специфичные к гормон-связывающим центрам моноклональных антител против E2 и реагирующие с мембранными ER [35].

Индукторами синтеза аутоантител против стероидных гормонов, очевидно, являются аддукты метаболитов E2 с ДНК, обнаруженные в клетках молочной железы и в опухолевых клетках [30, 31]. В свою очередь, в ответ на образование аутоантител против E2 и Pg могли бы появляться соответствующие антиидиотипические аутоантитела, по теории иммунологических сетей Йерне [26]. Наряду с этим причиной индукции синтеза аутоантител против рецепторов стероидных гормонов могли бы быть соматические мутации в генах этих рецепторов, обнаруженные в опухолевых клетках у больных РМЖ [6, 17, 24].

Кроме этого, в прогрессии РМЖ могли бы принимать участие и антитела против химических канцерогенов окружающей среды, в частности, против бензо[а]пирена (Bp). Известны взаимоусиливающие эффекты Bp, E2 и их метаболитов на биологические свойства опухолевых клеток молочной железы in vitro [25, 27]. В экспериментах с монослоями эпителиальных клеток убедительно доказано протективное действие модельных антител, имитирующих секреторные антитела, защищающее клетки от Bp, и стимулирующее действие модельных антител, имитирующих сывороточные антитела, усиливающее транспорт Bp из окружающей среды в кровь и образование генотоксических метаболитов Bp в клетках-мишенях [14, 15]. Иммунизация животных против Bp сопровождалась перераспределением этого вещества по разным органам при его последующем введении [10, 23].

Индукторами синтеза антител против Bp у человека, очевидно, служат аддукты его метаболитов с ДНК, в которых Bp выступает в роли гаптена [18, 33, 34]. В сыворотке крови больных РМЖ были обнаружены антитела против Bp, уровни которых были выше, чем у здоровых женщин [11].

Ранее мы обнаружили синергическое действие аутоантител класса А против E2 и Pg (IgA₁-E2 и IgA₁-Pg), стимулирующее пролиферацию опухоли, и противоположное синергическое действие соответствующих антиидиотипических аутоантител класса G (IgG₂-E2 и IgG₂-Pg), тормозящее пролиферацию опухоли, у больных со II-IV стадиями РМЖ [3]. Однако при этом не учитывалось очевидное одновременное присутствие в сыворотке крови этих больных, а значит и участие в регуляции прогрессии РМЖ следующих компонентов: самих стероидных гормонов, E2 и Pg; идиотипических аутоантител класса G против E2 и Pg (IgG₁-E2 и IgG₁-Pg); антител обоих классов против Bp (IgA₁-Bp и IgG₁-Bp).

Оценить результирующее действие на опухоль столь большого количества потенциально активных компонентов сыворотки крови в естественных условиях у больных РМЖ довольно сложная задача. В настоящей работе мы попытались решить ее с помощью относительного нового метода статистической обработки результатов – CART-анализа (Classification and Regression Tree), успешно применяемого в онкологии с подобными целями [28, 36].

Цель исследования – выявить предполагаемое участие в регуляции пролиферативной активности опухоли E2 и Pg, IgA₁-Bp и IgG₁-Bp, IgA₁-E2 и IgG₁-E2, IgA₁-Pg и IgG₁-Pg, IgG₂-E2 и IgG₂-Pg у больных РМЖ.

Материалы и методы

В настоящее исследование были включены 1258 женщин в постменопаузе. Все женщины впервые обратились в «Кузбасский клинический онкологический диспансер им. М.С. Раппопорта» г. Кемерово, до обращения к врачу-онкологу они не получали противоопухолевой химио- и/ или гормонотерапии. У всех женщин была диагностирована «инвазивная карцинома молочной железы неспецифического типа». Согласно TNM классификации у обследованных женщин РМЖ I стадии был диагностирован в 47,0%; II стадии – в 38,6%; III стадии – в 13,1%; IV стадии – в 1,3% случаев. Медиана возраста составила 65 лет (интерквартильный размах 60-71 год).

Маркер пролиферативной активности Ki-67 в опухолевых клетках определяли стандартным иммуногистохимическим методом в трепан-биоптатах, используя кроличьи антитела против Ki-67 (клон 30-9 CONFIRM, Ventana, США).

Венозную кровь забирали до начала лечения и с письменного информированного согласия женщин на участие в научных исследованиях. При заборе материала руководствовались этическими принципами Хельсинкской декларации (2013) и «Правилами клинической практики в Российской Федерации» (приказ Минздрава РФ № 266 от 19.06.2003).

Иммуноанализ идиотипических антител классов А и G, специфичных к бензо[a]пирену, эстрадиолу и прогестерону (IgА₁-Bp, IgА₁-E2, IgА₁-Pg, IgG₁-Bp, IgG₁-E2, IgG₁-Pg), осуществляли методом неконкурентного иммуноферментного анализа согласно методике [3]. Для сенсибилизации иммунологических планшетов использовали конъюгаты Bp, Е2 или Pg с бычьим сывороточным альбумином. Связавшиеся антитела выявляли козьими антителами против IgА или IgG человека, меченными пероксидазой хрена (Invitrogen, США), с разведением 1/10000 для IgА-антител и 1/7000 для IgG-антител. Уровни исследуемых антител выражали в условных единицах (у. е.) и рассчитывали по формуле [3] с учетом фонового связывания с белком-носителем.

Иммуноанализ антиидиотипических антител класса G, специфичных к E2 и Pg (IgG₂-E2, IgG₂-Pg), определяли методом неконкурентного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов «ИммуноФА-Эстрадиол», «ИммуноФА-ПГ» (ЗАО «НВО Иммунотех», Москва, Россия) с иммобилизованными на пластике моноклональными антителами против E2 или Pg согласно методике [3]. Для определения IgG₂-E2 и IgG₂-Pg использовали козьи антитела против IgG человека, меченные пероксидазой хрена (Invitrogen, США), с разведением 1/30000. Уровни IgG₂-E2 и IgG₂-Pg выражали в условных единицах (у. е.) и рассчитывали по формуле [3] с учетом фонового связывания меченных пероксидазой хрена козьих антител против IgG человека с моноклональными антителами против E2 или Pg без добавления сыворотки крови.

Определение концентрации стероидных гормонов в сыворотке крови женщин осуществляли с помощью коммерческих наборов «ИммуноФА-Эстрадиол», «ИммуноФА-ПГ» (ЗАО «НВО Иммунотех», Москва, Россия) согласно инструкции.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica 13.0 (StatSoft Inc., США). Различия между группами оценивали с помощью непараметрического критерия χ² с поправкой Йейтса на непрерывность вариации, т. к. распределение полученных показателей носило ненормальный характер согласно тесту по Шапиро–Уилку. Критический уровень значимости принимался p < 0,05. Оптимальные пороги отсечения (cut-off value) уровней исследуемых антител и гормонов были рассчитаны с помощью ROC-анализа между больными РМЖ I стадии с низким (≤ 20%) и высоким (> 20%) процентным содержанием Ki- 67 положительных клеток в опухоли [22]. Для построения цифровых моделей ассоциаций исследованных сывороточных факторов с уровнем Ki-67-положительных клеток в опухоли был использован алгоритм CART (Classification and Regression Trees). Для интерпретации полученных моделей были построены деревья решений, оптимальные значения гиперпараметров (максимальная глубина дерева, минимальное количество наблюдений в листе) были выбраны методом перекрестной валидации с целью минимизации ошибки классификации и предотвращения переобучения.

Результаты

С помощь ROC-анализа определили значения уровней исследуемых гормонов и аутоантител (cut-off), по которым больные с I стадией РМЖ различались по содержанию в опухоли Ki-67-положительных клеток (≤ 20% и > 20%). При анализе каждого из указанных факторов сыворотки по отдельности искомые ассоциации с пролиферативной активностью опухоли обнаружены в следующих случаях (табл. 1).

 

Таблица 1. Число (n) и доля (%) больных РМЖ с низким (≤ 20%) и высоким (> 20%) содержанием в опухоли Ki-67⁺ клеток в зависимости от низких (≤) и высоких (>) уровней исследованных факторов в сыворотке крови по ROC-анализу

Table 1. Number (n) and prevalence (%) of BCP with low (≤ 20%) and high (> 20%) levels of Ki-67⁺ tumor cells depended on personal studied blood serum factors according to ROC-analysis

Гормоны, антитела Hormones, antibodies	РМЖ I стадии BCP I stage (n = 620)		РМЖ II-IV стадий BCP II-IV stages (n = 638)
	Ki-67 ≤ 20%	Ki-67 > 20%	Ki-67 ≤ 20%	Ki-67 > 20%
	n/%	n/%	n/%	n/%
1.1. E2 ≤ 200 1.2. E2 > 200	238/60,4 115/50,9	156/39,6 111/49,1	146/40,0 100/36,1	215/59,6 177/63,9
χ2 (р), df = 1	4,9 (0,03)		1,1 (0,30)
2.1. Pg ≤ 700 2.2. Pg > 700	176/64,2 177/51,2	98/35,8 169/48,8	108/39,3 138/38,0	167/60,7 225/62,0
χ2 (р), df = 1	10,1 (0,001)		0,06 (0,81)
3.1. IgA1-Bp ≤ 4 3.2. IgA1-Bp > 4	187/54,5 166/59,9	156/45,5 111/40,1	155/42,1 91/33,7	213/57,9 179/66,3
χ2 (р), df = 1	1,6 (0,20)		4,3 (0,038)
4.1. IgG1-Bp ≤ 11 4.2. IgA1-Bp > 11	197/56,3 156/57,8	153/43,7 114/42,2	142/38,9 104/38,1	223/61,1 169/61,9
χ2 (р), df = 1	0,1 (0,77)		0,02 (0,90)
5.1. IgA1-E2 ≤ 3 5.2. IgA1-E2 > 3	188/57,1 165/56,7	141/42,9 126/43,3	143/41,7 103/34,9	200/58,3 192/65,1
χ2 (р), df = 1	0,01 (0,98)		2,7 (0,09)
6.1. IgG1-E2 ≤ 8 6.2. IgG1-E2 > 8	160/55,7 193/57,9	127/44,3 140/42,1	116/35,9 130/41,3	207/64,1 185/58,7
χ2 (р), df = 1	0,22 (0,64)		1,7 (0,19)
7.1. IgA1-Pg ≤ 2 7.2. IgA1-Pg > 2	204/57,9 149/55,6	148/42,1 119/44,4	138/41,4 108/35,4	195/58,6 197/64,6
χ2 (р), df = 1	0,3 (0,61)		2,2 (0,14)
8.1. IgG1-Pg ≤ 4 8.2. IgG1-Pg > 4	149/57,8 204/56,4	109/42,2 158/43,6	103/38,7 143/38,4	163/61,3 229/61,6
χ2 (р), df = 1	0,1 (0,79)		0,01 (0,99)
9.1. IgG2-E2 ≤ 4 9.2. IgG2-E2 > 4	153/56,9 200/56,9	116/43,1 151/43,1	121/36,2 125/41,1	213/63,8 179/58,9
χ2 (р), df = 1	0,01 (0,96)		1,4 (0,24)
10.1. IgG2-Pg ≤ 2,5 10.2. IgG2-Pg > 2,5	175/55,0 178/58,9	143/45,0 124/41,1	109/33,9 137/42,3	212/66,1 180/57,7
χ2 (р), df = 1	0,8 (0,37)		5,4 (0,02)

 

У больных с I стадией высокое содержание в сыворотке E2 (> 200 пмоль/л) и Pg (> 700 пмоль/л) было взаимосвязано с большим удельным весом активно пролиферирующих опухолей (p = 0,03 и p = 0,001, соответственно). Частота обнаружения опухолей с высоким содержанием Ki-67 экспрессирующих клеток не была ассоциирована с уровнями остальных изучаемых факторов у больных с I стадией РМЖ. У больных со II-IV стадиями искомые положительные взаимосвязи выявлены только с IgA₁-Bp > 4 у. е. (p = 0,038) и отрицательные – с IgG₂-Pg > 2,5 (p = 0,02). Следует отметить, что удельный вес больных с активно пролиферирующими опухолями у больных со II-IV стадиями был больше, чем у больных с I стадией (p < 0,001), как при низких, так и при высоких уровнях исследованных гормонов и аутоантител.

Однако такой распространенный метод статистической обработки результатов не дает совокупной оценки взаимосвязей всего комплекса потенциальных предикторов с теми или иными показателями прогрессии опухоли.

CART-анализ позволяет выделить из единого широкого спектра изучаемых факторов наиболее ассоциированные с теми или иными признаками прогрессии опухоли и сформировать наиболее значимые индивидуальные комбинации их содержания в сыворотке крови. При этом менее значимые (статистически недостоверные) факторы и их комбинации остаются за рамками так называемого «дерева решений».

Поскольку содержание в сыворотке указанных в цели настоящей работы гормонов и аутоантител и/или восприимчивость к ним клеток опухоли могли меняться по мере прогрессии РМЖ, CART-анализ использовали для исследования больных с I и со II-IV стадиями по отдельности. На рисунке 1 приведено «дерево решений» для больных с I стадией РМЖ.

 

Рисунок 1. CART-анализ исследуемых гормонов и аутоантител в соответствии с низким (≤ 20%) и высоким (> 20%) содержанием в опухоли Ki-67-положительных клеток у 620 больных с I стадией РМЖ

Figure 1. CART-analysis of the studied hormones and autoantibodies according to low (≤ 20%) and high (> 20%) levels of Ki-67 positive tumor cells in 620 I stage BCP

 

Из 620 пациенток 353 (56,9%) имели опухоли с низким содержанием Ki-67 положительных клеток (≤ 20%). У остальных 267 (43,1%) обнаружены активно пролиферирующие опухоли с Ki- 67 > 20%. Самым значимым фактором, определяющим пролиферативную активность опухоли, оказался Pg. При низких его концентрациях в сыворотке (≤ 490 пмоль/л у 155 больных) активно пролиферирующие опухоли встречались в 29,7%, а при высоких концентрациях (> 490 пмоль/л у 465 больных), такие опухоли диагностированы в 47,5% (p = 0,001).

В этой группе пролиферативная активность опухоли зависела от уровня IgA₁-Bp. У 153 больных с низкими уровнями этих антител (≤ 2,7 у. е.) опухоли с Ki-67 > 20% обнаруживали в 56,9%, а у 312 больных с высокими уровнями IgA₁-Bp (> 2,7 у. е.) – в 42,95% (p = 0,007).

В свою очередь, из 312 больных с высоким содержанием Pg (> 490 пмоль/л) + IgA₁-Bp (> 2,7 у. е.) у 140 обнаруживали высокие уровни IgG₂-E2 (> 4,6 у. е.) и активно пролиферирующие опухоли в 32,1%, а у 172 больных – низкие уровни IgG₂-E2 (≤ 4,6 у. е.) и опухоли с Ki-67 > 20% в 51,7% (p = 0,001).

В этой группе распределение больных зависело от IgA₁-E2. При низких уровнях этих антител (≤ 2,1 у. е.) у 23 больных активно пролиферирующие опухоли диагностированы в 21,7%, а при высоких их уровнях (> 2,1 у. е.) у 149 больных – в 56,4% (p = 0,005).

Из этих 149 женщин выделялись 66 больных с содержанием Pg от 490 до 886 пмоль/л с активно пролиферирующими опухолями в 69,7% случаев и 83 больных с Pg > 886 пмоль/л и с уровнями Ki- 67 > 20% в 45,8% (p = 0,006).

И, наконец, у 16 больных из этих 83 обнаруживали низкие уровни IgG₁-Bp (≤ 6,4 у. е.) и активно пролиферирующие опухоли в 75,0%, а у 67 – высокие уровни IgG₁-Bp (> 6,4 у. е.) и Ki-67 > 20% – в 38,3% случаев (p = 0,02).

Таким образом, CART-анализ показал, что у больных с I стадией РМЖ количество Ki-67-положительных клеток в опухоли было взаимосвязано со следующими пятью исследуемыми факторами сыворотки: Pg, IgA₁-Bp, IgG₂-E2, IgA₁-E2 и IgG₁-Bp. С остальными пятью факторами статистически значимых ассоциаций не обнаружено. Построенное «дерево решений» сформировало 7 групп больных по индивидуальным комбинациям указанных факторов, значимо взаимосвязанных с пролиферативной активностью опухоли. Итоговый результат CART-анализа по больным I стадии РМЖ представлен в таблице 2.

 

Таблица 2. Индивидуальные комбинации содержания в сыворотке исследуемых факторов, значимо ассоциированных с уровнем Ki-67⁺ клеток в опухоли (%), у 620 больных РМЖ I стадии по CART-анализу

Table 2. Individual combinations of studied serum factors levels significantly associated with the high level of Ki-67⁺ tumor cells (%) in 620 BCP stage I according to CART-analysis

Факторы сыворотки Factors of serum	Содержание фактора в сыворотке по группам. Удельный вес больных с высоким содержанием Ki-67+ клеток в опухоли (%) Serum factor levels by groups. Frequencies of patients with high levels of Ki-67+ cells in tumor (%)
	1	2	3	4	5	6	7
	29,7%	56,9%	32,2%	21,7%	69,7%	75,0%	38,8%
1. E2 pmol/L	–	–	–	–	–	–	–
2. Pg pmol/L	≤ 490	> 490	> 490	> 490	490-886	> 886	> 886
3. IgA1-Bp у. е. / c. u.	–	≤ 2,7	> 2,7	> 2,7	> 2,7	> 2,7	> 2,7
4. IgG1-Bp у. е. / c. u.	–	–	–	–	–	≤ 6,4	> 6,4
5. IgA1-E2 у. е. / c. u.	–	–	–	≤ 2,1	> 2,1	> 2,1	> 2,1
6. IgG1-E2 у. е. / c. u.	–	–	–	–	–	–	–
7. IgA1-Pg у. е. / c. u.	–	–	–	–	–	–	–
8. IgG1-Pg у. е. / c. u.	–	–	–	–	–	–	–
9. IgG2-E2 у. е. / c. u.	–	–	> 4,6	≤ 4,6	≤ 4,6	≤ 4,6	≤ 4,6
10. IgG2-Pg у. е. / c. u.	–	–	–	–	–	–	–
n/%	155/25,0	153/24,7	140/22,6	23/3,7	66/10,6	16/2,6	67/10,8

 

Видно, что в группах 2, 5 и 6 с общим количеством больных 235 (37,9%) активно пролиферирующие опухоли встречались чаще, чем в среднем при I стадии РМЖ в 56,9-75,0%. В группах 1, 3 и 4 с общим количеством больных 318 (51,3%) такие опухоли обнаруживались реже, в 21,7-32,1%. И в группе 7 (67 человек, 10,8%) эта частота (38,8%) не отличалась значительно от средней по всем больным с I стадией РМЖ (43,1%).

На рисунке 2 представлены результаты CART-анализа больных РМЖ на II-IV стадиях. У 392 из 638 (61,4%) Ki-67-положительных клеток в опухоли было > 20%. Наиболее значимыми из исследованных факторов сыворотки оказались только IgG₂-Pg и IgA₁-Bp. У 180 больных с невысокими уровнями IgG₂-Pg (≤ 1,9 у. е.) активно пролиферирующие опухоли обнаружены в 72,8%, а у 458 больных с высокими уровнями (> 1,9 у. е.) – в 57,0% (p < 0,001).

 

Рисунок 2. CART-анализ исследуемых гормонов и аутоантител в соответствии с низким (≤ 20%) и высоким (> 20%) содержанием в опухоли Ki-67-положительных клеток у 638 больных со II-IV стадиями РМЖ

Figure 2. CART-analysis of studied hormones and autoantibodies according to low (≤ 20%) and high (> 20%) levels of Ki-67 positive tumor cells in 638 II-IV stages BCP

 

Из этих 458 человек у 406 содержание IgG₂-Pg оказалось в интервале от 1,9 до 4,1 у. е., с активно пролиферирующими опухолями в 59,1%. У 52 больных обнаружены высокие уровни IgG₂-Pg (> 4,1 у. е.) и активно пролиферирующие опухоли в 40,4% (p = 0,016).

В свою очередь, эти 52 больные были разделены на 2 подгруппы в зависимости от уровней IgA₁-Bp. 29 из них с низкими уровнями (≤ 3,7 у. е.) и небольшой частотой активно пролиферирующих опухолей (24,1%). У 23 больных уровни IgA₁-Bp были выше 3,7 у. е. и активно пролиферирующие опухоли встречались в 60,9% (p = 0,008).

Таким образом, обнаружились явные различия между больными с I и со II-IV стадиями РМЖ по взаимосвязям исследуемых факторов в сыворотке и количеством Ki-67 экспрессирующих клеток в опухоли. Обусловлены ли эти различия изменениями чувствительности опухолевых клеток к этим факторам при ее росте или изменяются их уровни в сыворотке с течением заболевания? Для ответа на этот вопрос у больных с I стадией РМЖ были выделены 4 подгруппы с такими же параметрами IgG₂-Pg и IgA₁-Bp, какие определились при CART-анализе больных со II-IV стадиями. Оказалось (табл. 3), что удельный вес больных в каждой из выделенных подгрупп при I стадии почти не отличался от такового при II-IV стадиях (различия между ними не более 2,0%).

 

Таблица 3. Число (n) и доля (%) больных РМЖ с низким (≤ 20%) и высоким (> 20%) содержанием в опухоли Ki-67⁺ клеток в зависимости от индивидуальных комбинаций уровней исследованных факторов сыворотки крови по CART-анализу

Table 3. Number (n) and prevalence (%) of BCP with low (≤ 20%) and high (> 20%) levels of Ki-67⁺ tumor cells depended on personal combinations of studied blood serum factors according to CART-analysis

Уровни исследованных факторов и их комбинации по CART-анализу Studied factors levels and their combinations according to CART-analysis	РМЖ I стадии BCP I Stage (n = 620)			РМЖ II-IV стадий BCP II-IV stages (n = 638)			p I-(II-IV) Δ Ki-67 > 20%
	n/%	Ki-67 n/%		n/%	Ki-67 n/%
		≤ 20%	> 20%		≤ 20%	> 20%
1. IgG2-Pg < 1,9	167/26,9	95/56,8	72/43,2	180/28,2	49/27,2	131/72,8	< 0,001 +29,6
2. IgG2-Pg 1,9-4,1	383/61,8	223/58,2	160/41,8	406/63,6	166/40,9	240/59,1	< 0,001 +17,3
3. IgG2-Pg > 4,1 + IgA1-Bp > 3,7	31/5,0	17/54,8	14/45,2	23/3,6	9/39,1	14/60,9	0,386 +15,7
4. IgG2-Pg > 4,1 + IgA1-Bp ≤ 3,7	39/6,3	18/46,2	21/53,8	29/4,6	22/75,9	7/24,1	0,027 -29,7
p 1-2 p 1-3 p 1-4 p 2-4 p 3-4		0,843 0,989 0,301 0,200 0,630			0,003 0,344 < 0,001 < 0,001 0,017
1.1. IgG2-Pg < 1,9 + IgA1-Bp > 3,7	82/14,8	53/57,6	39/42,4	92/14,4	16/17,4	76/82,6	< 0,001 +40,2
1.2. IgG2-Pg < 1,9 + IgA1-Bp ≤ 3,7	75/12,1	42/56,0	33/44,0	88/13,8	33/37,5	55/62,5	0,028 +18,5
2.1. IgG2-Pg 1,9-4,1 +IgA1-Bp > 3,7	182/29,4	116/63,7	66/36,3	186/29,2	77/41,4	109/58,6	< 0,001 +22,3
2.2. IgG2-Pg 1,9-4,1 + IgA1-Bp ≤ 3,7	201/32,4	107/57,2	94/42,8	220/34,5	89/40,5	131/59,5	0,011 +16,7
p 1.1-1.2 p 3-1.1 p 4-2.2 p 4-1.2		0,959 0,952 0,403 0,318			0,004 0,048 < 0,001 < 0,001

 

Это косвенно подтверждает предположение о том, что индивидуальные комбинации содержания исследуемых гормонов и аутоантител, присущие пациенткам в начале заболевания, сохраняются при его развитии, изменятся только восприимчивость к ним клеток-мишеней при прогрессии опухоли.

При этом обнаружили характерные различия между больными с I и со II-IV стадиями в каждой из выделенных подгрупп по количеству активно пролиферирующих опухолей (∆Ki-67 > 20%). У больных с низкими уровнями IgG₂-Pg (< 1,9 у. е.) удельный вес таких опухолей возрастал на 29,6% (p < 0,001); у больных с уровнями IgG₂-Pg в интервале 1,9–4,1 у. е. он увеличивался на 17,3% (p < 0,001); при высоких уровнях IgG₂-Pg > 4,1 у. е. в комбинации с высокими уровнями IgA₁-Bp > 3,7 такое увеличение составляло 15,7% (p = 0,386). Напротив, у больных с IgG₂-Pg > 4,1 у. е. в комбинации с низкими уровнями IgA₁-Bp ≤ 3,7 у. е. активно пролиферирующие опухоли обнаруживали реже при II-IV стадиях по сравнению с I на 29,7% (p = 0,027).

Среди больных РМЖ со II-IV стадиями и низкими уровнями IgG₂-Pg < 1,9 у. е. (позиция 1 в табл. 3) выделили 2 подгруппы: с высокими и низкими уровнями IgA₁-Bp (позиции 1.1 и 1.2). Оказалось, что больных с активно пролиферирующими опухолями в подгруппе 1.1 было значимо больше, чем в подгруппе 1.2 (82,6% vs 62,5%, p = 0,004), и значимо больше, чем у больных с одновременно высокими уровнями IgG₂-Pg > 4,1 + IgA₁-Bp > 3,7 (позиция 3): 82,6% vs 60,9%, p = 0,048).

Также из группы больных со II-IV стадиями РМЖ с уровнями IgG₂-Pg в интервале 1,9-4,1 у. е. (позиция 2 в табл. 3) выделили 2 подгруппы с высокими и низкими уровнями IgA₁-Bp (позиции 2.1 и 2.2). Выяснилось, что больных с активно пролиферирующими опухолями в подгруппе 2.2 значимо больше, чем в группе 4 с более высокими уровнями IgG₂-Pg > 4,1 у. е. в сочетании с низкими уровнями IgA₁-Bp ≤ 3,7 у. е. (59,5% vs 24,1%, p < 0,001).

Обсуждение

Поиск новых иммунологических маркеров прогрессии опухоли и потенциальных средств иммунотерапии затрудняется сложностью взаимодействия различных иммунологических факторов с их мишенями и между собой. Например, если Pg угнетает E2 индуцированную пролиферацию опухолевых клеток молочной железы, как это было показано in vitro [13], то связывание Pg гаптен-специфическими аутоантителами у больных РМЖ in vivo может усиливать пролиферативное действие E2 даже при небольшой концентрации последнего. В свою очередь, связывание активных центров Pg-специфических аутоантител соответствующими антиидиотипическими аутоантителами «высвобождает» Pg и усиливает его антипролиферативное действие. При этом такие антиидиотипические аутоантитела, связываясь с мембранными PR, агонистически имитируют антипролиферативное действие Pg. Однако такое действие может быть заблокировано Pg-специфическими аутоантителами.

Если учесть, что в сыворотке крови одновременно присутствуют и гормоны с различными биологическими эффектами, и гормон-специфические аутоантитела, и соответствующие антиидиотипические аутоантитела (или аутоантитела, специфичные к стероидным гормонам), и антитела против химических канцерогенов, участвующих в малигнизации клеток-мишеней и т. д., то вклад каждого из них в результирующее действие всех участников интерпретировать довольно затруднительно. При этом и восприимчивость опухоли к внеклеточным факторам, очевидно, меняется по мере роста и при метастазировании хотя бы вследствие снижения экспрессии рецепторов или их соматических мутаций.

Анализ взаимосвязей пролиферативной активности опухоли с содержанием в сыворотке каждого из исследованных факторов по-отдельности с помощь ROC-анализа показал следующее. Опухоли с высоким содержанием Ki-67-положительных клеток обнаруживали чаще при высоких уровнях E2 (> 200 пмоль/л, p = 0,03) и Pg (> 700 пмоль/л, p = 0,001) у больных с I стадией РМЖ. Это соответствует известным данным о совместном участии Pg и E2 в возникновении РМЖ, на начальном этапе прогрессии [13, 29, 38].

У больных со II-IV стадиями искомых взаимосвязей с концентрацией гормонов в сыворотке не выявлено. В отличие от I стадии обнаружили положительные ассоциации высокого содержания в опухоли Ki-67-положительных клеток с высокими уровнями IgA₁-Bp > 4 у. е. (p = 0,038) и отрицательные с высокими уровнями IgG₂- Pg > 2,5 у. е. (p = 0,02). Ни с какими другими исследованными факторами сыворотки никаких ассоциаций не выявлено при исследовании ROC-анализа.

Учитывая большее или меньшее участие отдельных факторов в регуляции прогрессии опухоли и/или возможное взаимное нивелирование разнонаправленных биологических эффектов некоторых из них, оценили влияние всей совокупности этих факторов на пролиферацию опухоли с помощью CART-анализа.

У больных с I стадией РМЖ основным фактором, определяющим пролиферативную активность опухоли, оказался Pg. Его влияние не зависело от концентрации E2 в сыворотке. У больных с низкими уровнями Pg (≤ 460 пмоль/л) активно пролиферирующие опухоли определялись реже, чем у больных с высокими уровнями (p = 0,001), что соответствовало результату по ROC-анализу. Вместе с тем, у больных с высоким содержанием Pg (> 490 пмоль/л) пролиферативная активность опухоли зависела от уровней IgA₁-Bp, IgG₁-Bp, IgA₁-E2, IgG₂-E2.

По индивидуальным комбинациям высоких и низких уровней указанных аутоантител выделены отдельные подгруппы больных с высокой и низкой пролиферативной активностью опухоли. Сопоставление некоторых из них дает приблизительное представление об участии эти антител в Pg-зависимой регуляции пролиферации опухоли. Например, у больных с высоким содержанием Pg и комбинацией [IgA₁-Bp > 2,7 у. е. + IgA₁-E2 > 2,1 у. е. + IgG₂-E2 ≤ 4,6 у. е.] активно пролиферирующие опухоли встречались в 69,7%, а у больных с комбинациями [IgA₁-Bp > 2,7 у. е. + IgA₁-E2 ≤ 2,1 у. е. + IgG₂-E2 ≤ 4,6 у. е.] – значительно реже, в 21,7% (p < 0,001). Можно предположить, что IgA₁-Bp способны стимулировать Pg-зависимую пролиферацию опухоли только в присутствии IgA₁-E2 и отсутствии IgG₂-E2. Другой пример, у больных с комбинацией [IgA₁-Bp > 2,7 у. е. + IgA₁-E2 > 2,1 у. е. + IgG₂-E2 ≤ 4,6 у. е. + IgG₁-Bp ≤ 6,4 у. е.] активно пролиферирующие опухоли обнаруживали в 75,0%, а если уровни IgG₁-Bp были высокие (> 6,4 у. е.) – значительно реже, в 38,8% (p = 0,02). В данном случае IgG₁-Bp угнетал синергический эффект IgA₁-Bp + IgA₁-E2, стимулирующий Pg-зависимую пролиферацию опухоли.

У больных со II-IV стадиями РМЖ значимыми факторами, ассоциированными с пролиферацией опухоли по CART-анализу, оказались IgG₂- Pg и IgA₁-Bp, что соответствовало результатам ROC-анализа. При низких уровнях IgG₂-Pg ≤ 1,9 у. е., независимо от всех других исследованных факторов, в том числе E2 и Pg, опухоли с высоким содержанием Ki-67-положительных клеток встречались чаще, чем при высоких (72,8% vs 57,0%, p = 0,001). У больных с уровнями IgG₂-Pg от 1,9 до 4,1 у. е. активно пролиферирующие опухоли обнаруживали с частотой, средней для II-IV стадии (59,1%). Удельный вес больных с высокими уровнями IgG₂-Pg > 4,1 у. е. и активно пролиферирующими опухолями зависел от IgA₁- Bp. При низких уровнях IgA₁-Bp ≤ 3,7 у. е. он составлял 24,1%, а при высоких (> 3,7 у. е.) – 60,9% (p = 0,008). Таким образом, у больных РМЖ на II-IV стадиях IgG₂-Pg тормозил пролиферацию опухоли, особенно в отсутствии IgA₁-Bp. Полное нивелирование тормозящего действия IgG₂-Pg имело место в присутствии IgA₁-Bp.

Таким образом, выявлены явные различия во взаимосвязях пролиферативной активности опухоли с содержанием в сыворотке крови исследованных гормонов и аутоантител в начале заболевания и при дальнейшей прогрессии РМЖ. Это послужило основанием в поиске информативных предикторов скорости роста опухоли у больных с I стадией РМЖ.

С этой целью больных с I стадией разделили на 4 группы, соответствующие 4 группам больных со II-IV стадиями по параметрам IgG₂-Pg и IgA₁- Bp, определенным по CART-анализу (табл. 3). Оказалось, что представительство (удельный вес) больных в каждой группе при I стадии такое же, как и при II-IV стадиях. Это означало, что иммунологический фенотип (IgG₂-Pg и IgA₁-Bp), присущий больным при возникновении опухоли, сохранялся при ее дальнейшем росте, и различия по CART-анализу между больными с I и со II-IV стадиями были обусловлены, очевидно, изменениями чувствительности к ним клеток-мишеней. Поэтому по исходным иммунологическим параметрам в начале заболевания можно судить о прогнозе скорости роста опухоли в дальнейшем.

Оказалось, что удельный вес больных с активно пролиферирующими опухолями возрастает от I ко II-IV стадиям на 29,6% (p < 0,001) в группе с низкими уровнями IgG₂-Pg (< 1,9 у. е.); на 17,3% (p < 0,001) в группе с уровнями IgG₂-Pg в интервале 1,9-4,1 у. е.; на 15,7% (p = 0,386) в группе с высокими уровнями IgG₂-Pg (> 4,1 у. е.) в комбинации с высокими уровнями IgA₁-Bp (> 3,7 у. е.). В группе с высокими уровнями IgG₂-Pg в комбинации с низкими уровнями IgA₁-Bp (≤ 3,7 у. е.) имело место снижение удельного веса таких больных на 29,7% (p = 0,027).

Таким образом, IgG₂-Pg и IgA₁-Bp у больных РМЖ на I стадии можно рассматривать как перспективные предикторы дальнейшей скорости роста опухоли. Аналогичный алгоритм определения 5 потенциальных предикторов по полученным результатам CART-анализа больных с I стадией РМЖ (рис. 1) представляется значительно более трудоемким и затратным.

Очевидную значимость дефицита IgG₂-Pg, ассоциированного с высокой пролиферативной активностью опухоли, можно рассматривать как возможность искусственного восполнения этого дефицита для торможения роста опухоли. Расчеты, приведенные в таблице 3, показали, что при дефиците IgG₂-Pg (< 1,9 у. е.) в комплексе с высокими уровнями IgA₁-Bp (> 3,7 у. е.) удельный вес больных с активно пролиферирующими опухолями на II-IV стадиях составлял 82,6%, но при повышении уровня IgG₂-Pg > 4,1, этот показатель мог бы снизиться до 60,9% (p = 0,048). При комбинации IgG₂-Pg < 1,9 у. е. + IgA₁-Bp ≤ 3,7 у. е. удельный вес больных с активно пролиферирующими опухолями равнялся 62,5%, а при повышении уровня IgG₂-Pg выше 4,1 у. е. это значение могло бы снизиться до 24,1% (p < 0,001).

Если исследованные нами антиидиотипические аутоантитела IgG₂-Pg действительно связываются с мембранными PR и проявляют выраженное антипролиферативное действие, то создание искусственных анти-PR-антител для лечения РМЖ (по аналогии широко применяемыми антителами против рецепторов эпидермального фактора роста, герцептином и др.) представляется весьма перспективным.

Не меньшее внимание привлекают IgA₁-Bp, избыток которых (> 3,7 у. е.) ассоциирован с высокой пролиферативной активностью опухоли у больных со II-IV стадиями РМЖ как при низких уровнях IgG₂-Pg (< 1,9 у. е., p = 0,004), так и при высоких (> 4,1 у. е., p = 0,017). На основании результатов известных экспериментов in vitro [14, 15] можно предположить, что исследованные нами IgA₁-Bp, будучи сывороточными, способствуют проникновению Bp из окружающей среды в кровь, а по принадлежности к А классу секретируются в протоки молочной железы и тем самым способствуют накоплению в клетках-мишенях Bp, образованию генотоксических аддуктов Bp- ДНК и эпигенетической стимуляции пролиферации совместно с E2. В таком случае, предотвращение проникновения Bp из окружающей среды в кровь могло бы нивелировать стимулирующее пролиферацию опухолевых клеток действие сывороточных IgA₁-Bp. Различные подходы к созданию новых средств иммунопрофилактики химического стероид-зависимого канцерогенеза обсуждались нами ранее [2, 20, 21].

Заключение

Значимые взаимосвязи пролиферативной активности опухоли выявлены с помощью CART-анализа: у больных с I стадией РМЖ – с содержанием в сыворотке Pg, IgA₁-Bp, IgG₁-Bp, IgA₁-E2, IgG₂-E2; у больных со II-IV стадиями – с IgG₂-Pg и IgA₁-Bp. Обнаруженные различия обусловлены, очевидно, изменениями восприимчивости клеток-мишеней к стероидным гормонам и аутоантителам, специфичным к Bp, E2, Pg, ER и PR, но не изменениями уровней этих факторов в сыворотке крови по мере роста опухоли. Рекомендуется использовать иммуноанализ IgG₂-Pg и IgA₁-Bp в качестве дополнительного метода оценки пролиферативной активности опухоли. Целесообразно исследовать возможность применения рекомбинантных антител, специфичных к PR, в качестве антипролиферативных средств в лечении РМЖ.

About the authors

A. N. Glushkov

Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: egpolenok@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Chief Researcher, Laboratory of Immunogenetics

Russian Federation, Kemerovo

Elena G. Polenok

Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: egpolenok@mail.ru

PhD (Pharmacy), Leading Researcher, Laboratory of Immunochemistry

Russian Federation, Kemerovo

L. A. Gordeeva

Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: egpolenok@mail.ru

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Immunogenetics

Russian Federation, Kemerovo

S. A. Mun

Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: egpolenok@mail.ru

PhD (Medicine), Senior Researcher, Laboratory of Immunogenetics

Russian Federation, Kemerovo

A. E. Studennikov

Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: egpolenok@mail.ru

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Biotechnology

Russian Federation, Kemerovo

A. M. Eliseikin

Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: egpolenok@mail.ru

Leading Biological Engineer, Laboratory of Biotechnology

Russian Federation, Kemerovo

M. V. Kostyanko

Kemerovo State University

Email: egpolenok@mail.ru

Leading Engineer, Department of Fundamental and Applied Chemistry

Russian Federation, Kemerovo

V. N. Zakharov

Kuzbass Clinical Oncology Dispensary

Email: egpolenok@mail.ru

PhD (Medicine), Chief Physician

Russian Federation, Kemerovo

A. V. Antonov

Kuzbass Clinical Oncology Dispensary

Email: egpolenok@mail.ru

Head, Breast Cancer Department

Russian Federation, Kemerovo

P. V. Bayramov

Kuzbass Clinical Oncology Dispensary

Email: egpolenok@mail.ru

Head, Department of Pathology

Russian Federation, Kemerovo

N. E. Verzhbitskaya

Kuzbass Clinical Oncology Dispensary

Email: egpolenok@mail.ru

PhD (Medicine), Pathologist, Department of Pathology

Russian Federation, Kemerovo

G. I. Kolpinskiy

Kemerovo State Medical University; I. Kolpinsky Clinical Consultative and Diagnostic Center

Email: egpolenok@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Department of Radiology, Radiotherapy and Oncology, Chief Physician

Russian Federation, Kemerovo; Kemerovo

References

Supplementary files