Arachidonic acid enhances mitophagy and decreases inflammatory response in primary macrophages

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Macrophages are actively involved in recognition, capturing, and destruction of foreign pathogens, as well as removal of cellular debris. The most important role of macrophages is to initiate and regulate the inflammatory response: they synthesize and secrete a wide range of proinflammatory cytokines that activate other immune cells and promote the development of inflammation. The functional state of macrophages directly depends on mitochondrial activities, both as energy suppliers, and as key participants in signaling pathways associated with production of reactive oxygen species and inflammasome activation. Mitochondrial dysfunction may lead to excessive macrophage activation and chronic inflammation, typical of diseases like atherosclerosis and metabolic disorders. Damaged mitochondria release components such as mtDNA and cardiolipin, potentially triggering autoimmune responses. To prevent these events, the cells are capable of mitophagy, a selective autophagy process that removes dysfunctional mitochondria via the lysosomal pathway. Polyunsaturated fatty acids are known to influence inflammation and mitochondrial function, including mitophagy. Arachidonic acid, a precursor of prostaglandins and leukotrienes, modulates immune responses, but its role in mitophagy remains unclear. The aim of this study was to investigate whether arachidonic acid affects mitophagy and the proinflammatory response of human macrophages. Primary monocytes were isolated from whole blood of healthy donors and differentiated into macrophages over 5 days. The cells were treated with 20 μM arachidonic acid for 24 hours, followed by 1 μg/mL LPS stimulation for another 24 hours. Cytokine secretion (TNF, IL-6, IL-8, CCL2) was measured by ELISA technique. Mitophagy was assessed using confocal microscopy by evaluating co-localization of mitochondrial and lysosomal dyes. The results showed that arachidonic acid enhanced mitophagy and reduced secretion of TNF, IL6, and CCL2 in response to LPS. These findings suggest that activation of mitophagy may contribute to the anti-inflammatory effects of arachidonic acid in macrophages.

Full Text

Введение

При повреждении или дисфункции митохондрий в цитоплазму клетки-хозяина могут попадать митохондриальные компоненты (кардиолипин, мтДНК и др.), что может приводить к аутоиммунной реакции. Для того чтобы этого не происходило, существует митофагия – механизм, при котором дисфункциональные митохондрии подвергаются лизосомальной деградации [1, 8].

Известно, что некоторые полиненасыщенные жирные кислоты, в том числе и арахидоновая кислота (АК), оказывают влияние на воспалительный ответ иммунных клеток [2]. Более того, некоторые из них способны оказывать влияние на митофагию [11]. Однако влияние АК на митофагию не исследовалось.

Целью настоящей работы был ответ на вопрос, способна ли АК модулировать митофагию и воспалительный ответ макрофагов.

Материалы и методы

Первичные моноциты были выделены из цельной крови здоровых доноров методом адгезии. Сначала цельную кровь центрифугировали 20 мин при 800 g (без торможения). Затем отбирали 2/3 плазмы и добавляли PBS до первоначального объема, перемешивали и наслаивали на фиколл. Центрифугировали 20 мин при 800 g (без торможения). Переносили клетки интерфазного кольца в новые пробирки и дважды промывали PBS. Далее клеткам добавляли среду RPMI-1640 с L-глютамином и 10% FBS L-glutamine 10% FBS и инкубировали 2 часа в CO2-инкубаторе при 37 °С, 5% CO2 для прикрепления моноцитов. Далее снимали клетки при помощи триписин-версена, для инактивации трипсина использовали FBS. После чего клетки центрифугировали 10 мин при 300 g, добавляли в клеточному осадку X-Vivo и культивировали в концентрации 1 млн клеток/мл в течение 5 дней.

После 5-дневной инкубации к культуре макрофагов добавляли 20 мкМ АК на 1 день. Затем клетки промывали PBS и заменяли культуральную среду. После этого к культуре добавляли 1 мкг/мл ЛПС еще на 24 часа. Полученный супернатант отбирали для анализа уровней секреции цитокинов после стимуляции LPS. Наконец, концентрацию IL-6, IL-8, CCL2 и TNF в образцах культуральной среды оценивали методом ИФА.

Митохондриальный краситель MitoTracker Green (100 нМ) добавляли к макрофагам спустя 5 дней на 30 мин. Далее клетки промывали PBS и добавляли 20 мкМ АК на 1 день. После чего лизосомальный краситель LysoTracker Deep Red (50 нМ) добавляли в культуру на 30 минут. Наконец, получали изображения при помощи конфокального микроскопа Leica DMI8 STELLARIS 5.

Митофагию определяли как колокализацию митохондриального и лизосомального красителя с помощью программного обеспечения CellProfiler 4.2.4.

Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения IBM SPSS Statistics. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение среднего значения. Индивидуальные парные сравнения проводились с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Оказалось, что АК повышала уровень митофагии в макрофагах (рис. 1).

 

Рисунок 1. Влияние арахидоновой кислоты (АК) на митофагию в макрофагах

Примечание. А – конфокальные изображения макрофагов, масштаб – 3 мкм; Б – количественная оценка доли митохондрий локализованных в лизосомах. ** – р < 0,01 по результатам t-теста.

Figure 1. Effect of arachidonic acid (AA) on mitophagy in macrophages

Note. A, confocal images of macrophages, scale bar 3 μm; B, quantification of the proportion of mitochondria localized in lysosomes. **, p < 0.01 by t-test.

 

Для оценки влияния АК на воспалительную реакцию в клеточной культуре добавляли 20 мкМ АК на 24 часа с последующей сменой среды и добавлением 1 мкг/мл ЛПС еще на один день. Секрецию цитокинов IL-6, IL-8, CCL2 и TNF в культуральной среде оценивали с помощью ИФА (рис. 2А).

 

Рисунок 2. Влияние арахидоновой кислоты (АК) на провоспалительный ответ макрофагов

Примечание. А – дизайн эксперимента; Б – влияние АК на секрецию цитокинов IL-6, IL-8, CCL2, TNF первичными макрофагами в ответ на LPS. ** – р < 0,01; *** – р < 0,001 по результатам t-теста. Ns – нет достоверной значимости.

Figure 2. Effect of arachidonic acid (AA) on the proinflammatory response of macrophages

Note. A, experimental design; B, effect of AA on the secretion of cytokines IL-6, IL-8, CCL2, TNF by primary macrophages in response to LPS. **, p < 0.01; *** – p < 0.001 according to the results of t-test. Ns, not significant.

 

Оказалось, что АК снижала секрецию цитокинов IL-6, TNF и CCL2 макрофагами в ответ на стимуляцию LPS (рис. 2Б). При этом секреция хемокина IL-8 не менялась.

Известно, что АК участвует в воспалительном ответе, поскольку является предшественником для липидных модуляторов воспаления [12]. Ранее было продемонстрировано, что АК снижала секрецию цитокинов IL-6, TNF, IL-1β линиями клеток THP-1 и RAW264.7 при стимуляции LPS [3, 12]. При использовании АК в качестве пищевой добавки также наблюдались противовоспалительные эффекты [2]. В настоящем исследовании АК приводила к снижению секреции цитокинов IL-6, TNF и CCL2 LPS-стимулированными макрофагами человека.

Однако, насколько нам известно, результат, демонстрирующий способность АК активировать митофагию, был получен впервые. Ранее было показано, что линолевая кислота, которая является метаболическим предшественником АК, up-регулировала сигнальные пути, связанные с аутофагией, в гепатоцитах [11].

Некоторые активаторы митофагии, такие как уролитин А, аллиин, бергаптен, обладают противовоспалительными свойствами [4, 5, 6]. Интересно, что провоспалительная стимуляция макрофагов с помощью ЛПС снижает митофагию в клетках [7, 9, 10]. Вполне вероятно, что воспалительная реакция макрофагов и митофагия являются тесно связанными процессами. Можно предположить, что активация митофагии может быть одним из механизмов противовоспалительного действия АК. Однако остается неизвестным, ответственна ли митофагия, индуцированная АК, за снижение воспалительного ответа в клетках.

Заключение

Мы продемонстрировали, что АК способна активировать митофагию в макрофагах, что сопровождается снижением воспалительного ответа клеток.

Благодарности

Мы благодарим Центр коллективного пользования ИБГРАН за возможность использования оборудования.

×

About the authors

Alexander D. Zhuravlev

Research Institute of General Pathology and Pathophysiology

Author for correspondence.
Email: Zhuravel17@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0451-2594
SPIN-code: 7309-2433
Scopus Author ID: 57391753500
ResearcherId: CAJ-4942-2022

Junior Researcher, Laboratory of Angiopathology

Russian Federation, Moscow

Nikita G. Nikiforov

Research Institute of General Pathology and Pathophysiology; Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences; Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: nikiforov.mipt@googlemail.com
ORCID iD: 0000-0002-2082-2429

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Angiopathology, Research Institute of General Pathology and Pathophysiology; Senior Researcher, Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences; Senior Engineer, Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Russian Federation, Moscow; Moscow; Moscow

Svetlana S. Verkhova

Research Institute of General Pathology and Pathophysiology; A. Avtsyn Research Institute of Human Morphology, B. Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: verxova.svetlana@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7953-0586

Senior Laboratory Assistant, Laboratory of Angiopathology, Research Institute of General Pathology and Pathophysiology, Moscow; PhD student, A. Avtsyn Research Institute of Human Morphology, B. Petrovsky National Research Centre of Surgery

Russian Federation, Moscow; Moscow

Yegor E. Yegorov

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: yegorov58@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5990-4077

PhD, MD (Biology), Professor, Leading Researcher, Laboratory of Cancer Cell Biology

Russian Federation, Moscow

Mariam Ekta Bagheri

A. Avtsyn Research Institute of Human Morphology, B. Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: ms.bvgheri@gmail.com
Scopus Author ID: 0000-0001-7952-1068

Junior Researcher, Postgraduate Student, Laboratory of Cellular and Molecular Pathology of Cardiovascular System, A. Avtsyn Research Institute of Human Morphology

Russian Federation, Moscow

Alexander N. Orekhov

Research Institute of General Pathology and Pathophysiology

Email: alexandernikolaevichorekhov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3318-4681

PhD, MD (Biology), Professor, Head, Laboratory of Angiopathology

Russian Federation, Moscow

References

  1. Dabravolski S.A., Nikiforov N.G., Zhuravlev A.D., Orekhov N.A., Grechko A.V., Orekhov A.N. Role of the mtDNA mutations and mitophagy in inflammaging. Int. J. Mol. Sci., 2022, Vol. 23, no. 3, 1323. doi: 10.3390/ijms23031323.
  2. Djuricic I., Calder P.C. Beneficial Outcomes of Omega-6 and Omega-3 polyunsaturated fatty acids on human health: an update for 2021. Nutrients, 2021, Vol. 13, no. 7, 2421. doi: 10.3390/nu13072421.
  3. Hung H.C., Tsai S.F., Chou H.W., Tsai M.J., Hsu P.L., Kuo Y.M. Dietary fatty acids differentially affect secretion of pro-inflammatory cytokines in human THP-1 monocytes. Sci. Rep., 2023, Vol. 13, no. 1, 5511. doi: 10.1038/s41598-023-32710-5.
  4. Jayatunga D.P.W., Hone E., Khaira H., Lunelli T., Singh H., Guillemin G.J., Fernando B., Garg M.L., Verdile G., Martins R.N. Therapeutic potential of mitophagy-inducing microflora metabolite, urolithin a for Alzheimer’s Disease. Nutrients, 2021, Vol. 13, no. 11, 3744. doi: 10.3390/nu13113744.
  5. Liu M., Lu J., Yang S., Chen Y., Yu J., Guan S. Alliin alleviates LPS-induced pyroptosis via promoting mitophagy in THP-1 macrophages and mice. Food. Chem. Toxicol., 2022, Vol. 160, 112811. doi: 10.1016/j.fct.2022.112811.
  6. Luo T., Jia X., Feng W.D., Wang J.Y., Xie F., Kong L.D., Wang X.J., Lian R., Liu X., Chu Y.J., Wang Y., Xu A.L. Bergapten inhibits NLRP3 inflammasome activation and pyroptosis via promoting mitophagy. Acta Pharmacol. Sin., 2023, Vol. 44,no. 9, pp. 1867-1878.
  7. Nikiforov N.G., Chegodaev Y.S., Zhuravlev A.D., Vysokikh M., Marey M., Grechko A.V., Popov M.A., Bagheri Ekta M., Orekhov A.N. Inflammatory stimulation of monocyte-macrophages inhibits mitophagy. Minerva Biotechnol. Biomol. Res., 2023, Vol. 35, no. 3, pp. 145-150.
  8. Orekhov A.N., Nikiforov N.G., Omelchenko A.V., Sinyov V.V., Sobenin I.A., Vinokurov A.Y., Orekhova V.A. The role of mitochondrial mutations in chronification of inflammation: hypothesis and overview of own data. Life, 2022, Vol. 12, no. 8, 1153. doi: 10.3390/life12081153.
  9. Patoli D., Mignotte F., Deckert V., Dusuel A., Dumont A., Rieu A., Jalil A., van Dongen K., Bourgeois T., Gautier T., Magnani C., Le Guern N., Mandard S., Bastin J., Djouadi F., Schaeffer C., Guillaumot N., Narce M., Nguyen M., Guy J., Dargent A., Quenot J.-P., Rialland M., Masson D., Auwerx J., Lagrost L., Thomas C. Inhibition of mitophagy drives macrophage activation and antibacterial defense during sepsis. J. Clin. Invest., 2020, Vol. 130, no. 11, pp. 5858-5874.
  10. Wasner K., Smajic S., Ghelfi J., Delcambre S., Prada-Medina C.A., Knappe E., Arena G., Mulica P., Agyeah G., Rakovic A., Boussaad I., Badanjak K., Ohnmacht J., Gérardy J.-J., Takanashi M., Trinh J., Mittelbronn M., Hattori N., Klein C., Antony P., Seibler P., Spielmann M., Pereira S.L., Grünewald A. Parkin deficiency impairs mitochondrial DNA dynamics and propagates inflammation. Mov. Disord., 2022, Vol. 37, no. 7, pp. 1405-1415.
  11. Yang B., Zhou Y., Wu M., Li X., Mai K., Ai Q. ω-6 Polyunsaturated fatty acids (linoleic acid) activate both autophagy and antioxidation in a synergistic feedback loop via TOR-dependent and TOR-independent signaling pathways. Cell Death Dis., 2020, Vol. 11, no. 7, 607. doi: 10.1038/s41419-020-02750-0.
  12. Zhang Y., Chen H., Zhang W., Cai Y., Shan P., Wu D., Zhang B., Liu H., Khan Z.A., Liang G. Arachidonic acid inhibits inflammatory responses by binding to myeloid differentiation factor-2 (MD2) and preventing MD2/toll-like receptor 4 signaling activation. Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis., 2020, Vol. 1866, no. 5, 165683. doi: 10.1016/j.bbadis.2020.165683.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Figure 1. Effect of arachidonic acid (AA) on mitophagy in macrophages

Download (403KB)
Indexing metadata
3. Figure 2. Effect of arachidonic acid (AA) on the proinflammatory response of macrophages

Download (188KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2026 Zhuravlev A.D., Nikiforov N.G., Verkhova S.S., Yegorov Y.E., Bagheri M.E., Orekhov A.N.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.