PhD (Сhemistry), Senior Research Associate, Laboratory of Molecular Diagnostics
к.х.н., старший научный сотрудник
Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Diagnostics
младший научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики
PhD (Сhemistry), Junior Research Associate, Laboratory of Carbohydrates
к.х.н., младший научный сотрудник лаборатории углеводов
PhD, MD (Biology), Corresponding Member, Russian Academy of Sciences, Head, Laboratory of Molecular Diagnostics
д.б.н., член-корр. РАН, заведующий лабораторией молекулярной диагностики
The problem of detecting tiny quantities of analytes by immunochemical methods has been tried for a long time. One approach is to use nucleic acid amplification methods to amplify the signal from a single antigen-antibody interaction. An amplification method suitable for microarrays is the rolling circle amplification reaction. The principle of the method is usage of a conjugate of a detecting antibody with a primer and subsequent isothermal amplification. The generation of a huge single-stranded reaction product starts after adding the necessary components for amplification reaction: circular oligonucleotides, which serves as a template for amplification and phage phi29 polymerase with the other components. This reaction product consists of a lot of repeats of a nucleotide sequence, that is complementary to the circular template. The fluorescent DNA probe can hybridize to each repeat on the product molecule, resulting in a significantly higher level of fluorescence than with fluorescently labeled antibody or streptavidin development systems. In addition, the reaction product remains immobilized on the surface, allowing usage of this approach for the detection of antigen-antibody interactions in other solid-phase analysis systems, such as microarrays. A common problem with such approaches is the nonspecific sorption of components of the immunochemical reaction or amplification reaction, leading to a high background. It is obvious that no matter how highly sensitive the analysis is in theory, a high background will reduce the entire potential of the method to nothing. Herein, we have developed a method that makes it possible to detect small amounts of antibodies to glycans in blood serum and in swabs from tumor cells in a microarray format using a model of blood group antigens. It was possible to obtain a 30 to 70-fold increase of fluorescence level from a specific interaction compared to the use of fluorescently labeled streptavidin. The method we are developing is promising, as it allows us to significantly increase the signal from the specific antigen/antibody interaction in the glycochip format, which will make it possible to detect antibodies to glycans in samples with a very low concentrations of antibodies, for example, in washes from tumor cells.
Проблему детекции малых количеств аналитов иммунохимическими методами пытаются решить давно. Одним из подходов является использование методов амплификации нуклеиновых кислот для усиления сигнала от единичного акта взаимодействия антиген-антитело. Методом амплификации, подходящим для использования на микрочипах, является реакция амплификации катящимся кольцом.
Принцип метода заключается в использовании конъюгата детектирующего антитела с праймером и последующей изотермической амплификации. После добавления к иммобилизованному праймеру кольцевых олигонуклеотидов, которые служат матрицей для амплификации (либо олигонуклеотидов, которые могут гибридизоваться с праймером и быть лигированы в кольцевую матрицу) и полимеразы фага phi29 с необходимыми для начала амплификации компонентами, начинается образование протяженного (до сотен тысяч нуклеотидов) одноцепочечного продукта реакции. Продукт представляет собой повторы нуклеотидной последовательности, комплементарной кольцевой матрице. Флуоресцентный ДНК-зонд может гибридизоваться с каждым повтором на молекуле продукта, таким образом уровень флуоресценции становится значительно выше, чем при использовании систем проявки с применением флуоресцентно-меченных антител или стрептавидина. Кроме того, продукт реакции остается иммобилизованным на поверхности, что позволяет использовать данный подход при детекции взаимодействий антиген-антитело в других твердофазных системах анализа, таких как микрочипы. Общей проблемой таких подходов является неспецифическая сорбция компонентов иммунохимической реакции либо реакции амплификации, приводящая к высокому фону. Очевидно, что каким бы высокочувствительным анализ ни был в теории, высокий фон сведет весь потенциал метода на нет.
В настоящей работе мы разработали метод, позволяющий детектировать малые количества антител к гликанам в сыворотке крови и в смывах с опухолевых клеток в формате микрочипа на модели антигенов группы крови. Удалось получить 30-70 кратный прирост флуоресценции от специфического взаимодействия по сравнению с использованием флуоресцентно-меченного стрептавидина. Разрабатываемый нами метод является перспективным, так как позволяет значительно увеличить сигнал от специфического взаимодействия антиген-антитело в формате гликочипа, что позволит детектировать антитела к гликанам в образцах с очень небольшой концентрацией антител, например, в смывах с опухолевых клеток.