Russian Journal of ImmunologyRussian Journal of ImmunologyРоссийский иммунологический журнал1028-72212782-7291Russian Society of Immunology1693910.46235/1028-7221-16939-MATSHORT COMMUNICATIONSКРАТКИЕ СООБЩЕНИЯShort CommunicationMethodological approaches to the comparative assessment of cellular reactions of innate immunity in mollusk Pomacea sp. (Caenogastropoda, Ampullariidae) in experimental aseptic inflammationМетодические подходы к сравнительной оценке клеточных реакций врожденного иммунитета у моллюсков Pomacea sp. (Caenogastropoda, Ampullariidae) при экспериментальном асептическом воспаленииKhrushchevK. A.ХрущёвК. А.
Russian Federation

4th year Student, Biological Faculty

студент 4-го курса биологического факультета

jshilov@mail.ruShilovS. Yu.ШиловС. Ю.
Russian Federation

PhD (Medicine), Junior Research Associate, Laboratory of Ecological Immunology, Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; Associate Professor, Department of Normal Physiology, E. Wagner Perm State Medical University

к.м.н., младший научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии, Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук; доцент кафедры нормальной физиологии ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения РФ

jshilov@mail.ruBarkovS. Yu.БарковС. Ю.
Russian Federation

Postgraduate Student, Laboratory of Ecological Immunology, Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; Senior Laboratory Assistant, Department of Immunology, E. Wagner Perm State Medical University

очный аспирант лаборатории экологической иммунологии, Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук; старший лаборант кафедры иммунологии ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения РФ

jshilov@mail.ruShilovYu. I.ШиловЮ. И.
Russian Federation

PhD (Medicine), Associate Professor, Senior Research Associate, Laboratory of Ecological Immunology, Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; Associate Professor, Department of Immunology, E. Wagner Perm State Medical University, Perm, Russian Federation; Associate Professor, Department of Microbiology and Immunology, Perm State University

к.м.н., доцент, старший научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии, Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук; доцент кафедры иммунологии ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения РФ; доцент кафедры микробиологии и иммунологии ФГАОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

jshilov@mail.ruPerm State UniversityФГАОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of SciencesИнститут экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наукE. Wagner Perm State Medical UniversityФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения РФ251020242747497560904202409042024Copyright ©; 2024, Khrushchev K.A., Shilov S.Y., Barkov S.Y., Shilov Y.I.Copyright ©; 2024, Хрущёв К.А., Шилов С.Ю., Барков С.Ю., Шилов Ю.И.2024Khrushchev K.A., Shilov S.Y., Barkov S.Y., Shilov Y.I.Хрущёв К.А., Шилов С.Ю., Барков С.Ю., Шилов Ю.И.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://rusimmun.ru/jour/article/view/16939

One of the significant methodological problems that arise in the study of cells of the innate immunity of invertebrates is the unsuitability of culture media and even salt solutions intended for mammals and humans. Another important methodological point is the significantly pronounced reactions of coagulation, which play an important protective role in all invertebrates, but manifest themselves in vitro in cellular suspensions prepared even with optimal saline solutions for this animal. To solve this problem, researchers widely use an anticoagulation buffer with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) even in functional tests. From the standpoint of traditional approaches of mammalian immunology, the use of EDTA is possible only for the study of cell morphology, but not their functions. The aim of the work is to adapt methodological approaches to the comparative assessment of cellular reactions of innate immunity in Pomacea sp mollusks in experimental aseptic inflammation. To evaluate the functions of phagocytic cells in mollusk Pomacea sp., we used a complete salt solution (CSS) with optimal concentrations of glucose, calcium ions, magnesium with addition to prevent coagulation, cellular aggregation and degranulation instead of EDTA sodium salt of heparin at a concentration of 100 IU/mL (CSS-hep). As a result of a specially conducted experiment, it was shown that during incubation of hemolymph cells in this solution, their viability is preserved, evaluated by flow laser cytometry during incubation with annexin V-PE (PE Annexin V) and 7-aminoactinomycin D (7- AAD), as well as in a test with trypan blue. The possibility of studying the phagocytic activity and a phagosome acidification of leukocytes from hemolymph, hematopoiesis organ (kidney) and the focus of inflammation induced by intramuscular injection of sterile suspension of zymosan using CSS-hep is shown. Unlike the Limnaea stagnalis and Biomphalaria glabrata mollusks, in which the production of reactive oxygen species by phagocytes in the luminol-dependent chemiluminescence reaction is well documented, we were unable to induce this reaction in Pomacea sp. mollusks. In a specially conducted experiment, we did not reveal the effect of the sodium salt of heparin at a concentration of 100 IU/mL on the production of reactive oxygen species by rat phagocytes.

Одной из существенных методических проблем, возникающих при исследовании клеток врожденного иммунитета беспозвоночных животных, является непригодность культуральных сред и даже солевых растворов, предназначенных для млекопитающих и человека. Другой важный методический момент – значительно выраженные реакции коагуляции, играющие важнейшую защитную роль у всех беспозвоночных животных, но проявляющиеся in vitro в клеточных суспензиях, приготовленных даже на оптимальных для данного животного солевых растворах. Для решения этой проблемы современные исследователи широко используют даже в функциональных тестах антикоагуляционный буфер с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА). С позиций традиционных подходов иммунологии млекопитающих использование ЭДТА возможно только для исследования морфологии клеток, но не их функций. Цель работы – адаптация методических подходов к сравнительной оценке клеточных реакций врожденного иммунитета у моллюсков Pomacea sp. при экспериментальном асептическом воспалении. Для оценки функций фагоцитирующих клеток у моллюсков Pomacea sp. мы использовали полный солевый раствор (ПСР) с оптимальными концентрациями глюкозы, ионов кальция, магния с обязательным добавлением для предотвращения коагуляции, клеточной агрегации и дегрануляции вместо ЭДТА натриевой соли гепарина в концентрации 100 ЕД/мл (ПСР-геп). В специально проведенном эксперименте показано, что при инкубации клеток гемолимфы в этом растворе сохраняется их жизнеспособность, оцениваемая методом проточной лазерной цитометрии при инкубации с аннексином V-PE (PE Annexin V) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD), а также в тесте с трипановым синим. Показана возможность исследования с использованием ПСР-геп поглотительной активности и ацидификации фагосом лейкоцитов гемолимфы, органа кроветворения (почки) и очага воспаления, индуцированного внутримышечным введением стерильной суспензии зимозана. В отличие от моллюсков Lymnaea stagnalis и Biomphalaria glabrata, у которых хорошо документирована продукция активных форм кислорода фагоцитами в реакции люминолзависимой хемилюминисценции, мы не смогли индуцировать эту реакцию у моллюсков Pomacea sp. В специально проведенном эксперименте мы не выявили влияния натриевой соли гепарина в концентрации 100 ЕД/мл на продукцию активных форм кислорода фагоцитами крыс.

mollusksPomacea sp.CaenogastropodaAmpullariidaeinnate immunityphagocytosispHrodoTMluminol-dependent chemiluminescenceinflammationcomparative immunologyмоллюскиPomacea sp.CaenogastropodaAmpullariidaeврожденный иммунитетфагоцитозpHrodoTMлюминолзависимая хемилюминисценциявоспалениесравнительная иммунологияМинистерство науки и высшего образования Российской ФедерацииMinistry of Science and Higher Education of the Russian Federation124020500027-7Глупов В.В., Слепнева И.А. Механизмы цитотоксичности // Патогены насекомых: Структурные и функциональные аспекты / Под ред. В.В. Глупова. М.: Круглый год, 2001. С. 501-513. [Glupov V.V., Slepneva I.A. Mechanisms of cytotoxicity. In: Insect pathogens: Structural and functional aspects. Ed.by V.V. Glupov]. Moscow: Kruglyy god, 2001, pp. 501-513.Мечников И.И. Лекции о сравнительной патологии воспаления, читанные в апреле и мае 1891 г. в Пастеровском Институте. СПб.: К.Л. Риккера, 1892. 162 c.; Мечников И.И. Лекции о сравнительной патологии воспаления. – 2-е изд. – М., Птг.: Гос. изд-во, 1923. 173 с. [Leçons sur la pathologie comparée de l’inflammation: faites à l›Institut Pasteur en avril et mai 1891 / par Élie Metchnikoff , Chef de Service and l’lnstitut Pasteur. Paris: G. Masson. 1892; Lectures on the comparative pathology of inflammation delivered at the Pasteur Institute in 1891 / by Elie Metchnikoff; translated from the French by F.A. Starling and E.H. Starling. Metchnikoff, Elie, 1845-1916. Date: 1893.Шилов Ю.И., Шилов С.Ю., Барков С.Ю., Туляев Я.А., Котегов В.П., Баева Т.А., Шилова Н.А. Нейроэндокринная и фармакологическая регуляция функций фагоцитирующих клеток при экспериментальном зимозановом перитоните // Вестник Пермского федерального исследовательского центра, 2021. № 2. С. 15-26. [Shilov Ju.I., Shilov S.Ju., Barkov S.Ju., Tulyaev Ya.A., Kotegov V.P. Baeva T.A., Shilova N.A. Neuroendocrine and pharmacological regulation of functions of phagocytic cells under experimental zymosan-induced peritonitis. Vestnik Permskogo federalnogo issledovatelskogo tsentra = Perm Federal Research Center Journal, 2021, no. 2, pp. 15-26. (In Russ.)]Adema C.M., van Deutekom-Mulder E.C., van der Knaap W.P.W., Sminia T. Schistosomicidal activities of Lymnaea stagnalis haemocytes: the role of oxygen radicals. Parasitology, 1994, Vol. 109, Pt 4, pp. 479-485.Cooper E.L. Advances in comparative immunology. Introduction. In: Advances in Comparative Immunology. Ed. by Edwin L. Cooper. Publisher: Springer International Publishing, 2018, pp. XIII-XVIII.Cueto J.A., Giraud-Billoud M., Vega I.A., Castro-Vazquez A. Haemolymph plasma constituents of the invasive snail Pomacea canaliculata (Caenogastropoda, Architaenioglossa, Ampullariidae). Molluscan Res., 2011, Vol. 31, pp. 57-60.Cueto J.A., Rodriguez C., Vega I.A., Castro-Vazquez A. Immune defenses of the invasive apple snail Pomacea canaliculata (Caenogastropoda, Ampullariidae): Phagocytic hemocytes in the circulation and the kidney. PLoS One, 2015, Vol. 10, no. 4, e0123964. doi: 10.1371/journal.pone.0123964.Exotic animal laboratory diagnosis. Ed. by J. Jill Heatley, Karen Russell. Description: Hoboken N.J.: Wiley Blackwell, 2020. 630 p.Ginsburg I., Misgav R., Gibbs D.F., Varani J., Kohen R. Chemiluminescence in activated human neutrophils: role of buffers and scavengers. Inflammation, 1993, Vol. 17, no. 3, pp. 227-243.Jiravanichpaisal P., Lee B.L., Söderhäll K. Cell-mediated immunity in arthropods: hematopoiesis, coagulation, melanization and opsonization. Immunobiologym, 2006, Vol. 211, no. 4, pp. 213-236.Lemaitre B., Nicolas E., Michaut L., Reichhart J.M., Hoffmann J.A. The dorsoventral regulatory gene cassette spätzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell, 1996, Vol. 86, no. 6, pp. 973-983.Medzhitov R., Janeway C.A. Jr. Innate immunity: the virtues of a nonclonal system of recognition. Cell, 1997, Vol. 91, no. 3, pp. 295-298.Poltorak A., He X., Smirnova I., Liu M.Y., Van Huffel C., Du X., Birdwell D., Alejos E., Silva M., Galanos C., Freudenberg M., Ricciardi-Castagnoli P., Layton B., Beutler B. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science, 1998, Vol. 282, no. 5396, pp. 2085-2088.Rodriguez C., Simon V., Conget P., Vega I.A. Both quiescent and proliferating cells circulate in the blood of the invasive apple snail Pomacea canaliculata. Fish Shellfish Immunol., 2020, Vol. 107, Pt A, pp. 95-103.Song W.Y., Wang G.L., Chen L.L., Kim H.S., Pi L.Y., Holsten T., Gardner J., Wang B., Zhai W.X., Zhu L.H., Fauquet C., Ronald P. A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene, Xa21. Science, 1995, Vol. 270, no. 5243, pp. 1804-1806.