Phagocytic activity (PA) of blood leukocytes for Yersinia pestis reflects the state of cellular anti-plague immunity in humans and laboratory animals. The purpose of this work was to evaluate the stimulatory effect of anti-plague vaccination on the PA of peripheral blood leukocytes by in vitro assay using flow cytometry and a biofluorescent strain of Y. pestis EV NIIEG pTurboGFP-B (KM2115), expressing the green fluorescent protein (GFP). We studied leukocytes the 100-μL samples of heparinized whole blood of mice, guinea pigs and humans that were vaccinated with live plague vaccine, as compared with non-vaccinated controls. The suspensions of living KM2115 cells were mixed to blood samples diluted with physiological solution. The result of the phagocytic reaction was assessed after 15 minutes by flow cytometry thus determining the proportion of active phagocytes in the granulocyte gate that showed intense fluorescence in the green area of the spectrum. The data analysis was carried out by the previously developed protocol based on experiments with killed plague microbes labeled with FITC dye. The obtained experimental data have suggested an opportunity of using a biofluorescent Y. pestis strain for the rapid determination of granulocyte PA by flow cytometry in microvolumes of whole blood from humans and animals without longer preliminary staining of microbes with a fluorescent dye. Increased values of phagocytic indices were registered for blood cells of people and animals vaccinated against plague, thus being consistent with data on the stimulatory effect of anti-plague vaccination on the phagocytic function of leukocytes. The use of a biofluorescent strain has simplified the procedure for modeling the interaction of macroorganism cells with plague microbes and subsequent assessment of neutrophil PA in whole peripheral blood, thus enabling its usage to characterize the magnitude of post-vaccination anti-plague immune response by an in vitro test.
Фагоцитарная активность (ФА) лейкоцитов крови по отношению к Yersinia pestis отражает состояние клеточного противочумного иммунитета у людей и лабораторных животных. Целью настоящей работы явилась оценка стимулирующего эффекта противочумной вакцинации на ФА лейкоцитов периферической крови в тесте in vitro c использованием проточной цитометрии и биофлуоресцентного штамма Y. pestis EV НИИЭГpTurboGFP-B (КМ2115), экспрессирующего зеленый флуоресцирующий белок GFP. Исследовали лейкоциты в 100 мкл цельной гепаринизированной крови мышей, морских свинок и людей, привитых и не привитых живой чумной вакциной. Фагоцитарную реакцию моделировали путем добавления живых клеток штамма КМ2115 в кровь, разведенную физиологическим раствором, и результат учитывали через 15 мин методом проточной цитометрии, определяя в гейте гранулоцитов долю активных фагоцитов, обладающих интенсивной флуоресценцией в зеленой области спектра. Анализ проводили согласно протоколу, разработанному нами ранее в опытах с убитым чумным микробом, меченым красителем ФИТЦ. Получены экспериментальные данные, свидетельствующие о возможности использования биофлуоресцентного штамма Y. pestis для быстрого определения ФА гранулоцитов методом проточной цитометрии в микрообъемах цельной крови человека и животных без длительного предварительного окрашивания микроба флуоресцирующим красителем. Для клеток крови привитых против чумы людей и животных зарегистрированы повышенные значения фагоцитарных индексов, что согласуется с данными о стимулирующем эффекте противочумной вакцинации на фагоцитарную функцию лейкоцитов. По данным проточной цитометрии, активные фагоциты крови мышей контрольной группы флуоресцировали в зеленой области спектра после контакта in vitro c живыми клетками штамма КМ 2115 интенсивнее фагоцитов морских свинок и человека, что могло быть связано с видовой особенностью состава мышиных лейкоцитарных протеаз и, как следствие, с повышенной экспрессией белка GFP в бактериях, поглощенных мышиными фагоцитами. Применение биофлуоресцентного штамма упрощает процедуру моделирования взаимодействия клеток макроорганизма с чумным микробом и последующую оценку ФА нейтрофилов в образцах цельной периферической крови, что может быть использовано для характеристики напряженности клеточного поствакцинального противочумного иммунитета в тесте in vitro.