Russian Journal of ImmunologyRussian Journal of ImmunologyRussian Journal of Immunology1028-72212782-7291Russian Society of Immunology1712510.46235/1028-7221-17125-POCSHORT COMMUNICATIONSКРАТКИЕ СООБЩЕНИЯShort CommunicationPrecultivation of cells subjected to long-term cryopreservation negatively affects proliferative activity of T lymphocytesПрекультивирование клеток, подвергавшихся длительной криоконсервации, негативно влияет на пролиферативную активность Т-лимфоцитовKorolevskayaLarisa B.КоролевскаяЛариса Борисовна
Russian Federation

PhD (Medicine), Researcher, Laboratory of Ecological Immunology, Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms

к.м.н., научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии, Институт экологии и генетики микроорганизмов

bioqueen@mail.ruShmagelK. V.ШмагельК. В.
Russian Federation

PhD, MD (Medicine), Head, Laboratory of Ecological Immunology, Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms

д.м.н., заведующий лабораторией экологической иммунологии, Институт экологии и генетики микроорганизмов

bioqueen@mail.ruPerm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of SciencesФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук26052025180920252834254301803202525052025Copyright ©; 2025, Korolevskaya L.B., Shmagel K.V.Copyright ©; 2025, Королевская Л.Б., Шмагель К.В.2025Korolevskaya L.B., Shmagel K.V.Королевская Л.Б., Шмагель К.В.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://rusimmun.ru/jour/article/view/17125

Peripheral blood mononuclear cells are a valuable biological material for most immunological studies. Cryopreservation of peripheral blood mononuclear cells provides access to large amounts of biomaterial at any time. Since cryopreservation can affect various cell parameters, several authors have proposed introducing a precultivation step for thawed cells to restore their functions. The aim of the study is to evaluate the effect of preculturing long-term cryopreserved cells on T lymphocyte proliferative capacity. Venous blood obtained from 18 relatively healthy volunteers who signed informed consent was used. Mononuclear leukocytes were isolated by centrifugation in a diacoll density gradient using a standard method. The resulting cells were subjected to controlled freezing at -80 °C for 24 hours before being transferred to liquid nitrogen. The duration of sample storage was 40±1.4 months. After thawing, the cells were divided into two parts; one part was immediately stained with 5(6)-carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester (CFSE), stimulated with phytohemagglutinin, and cultured in complete culture medium containing interleukin-2 for 7 days. The second part of the cells was precultivated in complete culture medium (18 hours) and then treated as described above. T lymphocyte proliferation was assessed by flow cytometry. It was found that the preculture stage did not affect the relative counts of proliferating T lymphocytes. However, the number of daughter generations formed by both CD4+ and CD8+T lymphocytes was reduced in samples with precultured cells. Additionally, a significant increase in the proportion of dying elements among dividing CD4+T cells was observed. This consequence of the preculture stage was not found in the pool of CD8+T lymphocytes. Thus, preculturing significantly increases the percentage of T lymphocytes dying during division. This phenomenon was only detected among CD4+T cells, which appears to reflect their greater sensitivity to in vitro death compared to CD8+T lymphocytes.

Мононуклеарные клетки периферической крови являются ценным биологическим материалом для большинства иммунологических исследований. Криоконсервация мононуклеарных клеток периферической крови обеспечивает доступ к большим объемам биоматериала в любой момент времени. Исходя из того, что криоконсервация может влиять на различные параметры клеток, рядом авторов было предложено введение этапа прекультивирования размороженных клеток для восстановления их функций. Цель исследования – оценка влияния прекультивирования клеток, подвергавшихся длительной криоконсервации, на пролиферативную активность Т-лимфоцитов. В работе была использована венозная кровь, полученная от 18 относительно здоровых добровольцев, подписавших информированное согласие. Мононуклеарные лейкоциты выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности диаколла общепринятым методом. Полученные клетки подвергали контролируемому замораживанию до -80 °С в течение суток, затем переносили в жидкий азот. Длительность хранения образцов составила 40±1,4 мес. После размораживания клетки делили на две части, одну из которых сразу окрашивали 5(6)-карбоксифлуоресцеин диацетат-N-сукцинимидиловым эфиром (CFSE), стимулировали фитогемагглютином и культивировали в полной питательной среде, содержащей интерлейкин-2, в течение 7 суток. Вторую часть клеток прекультивировали в полной питательной среде (18 часов), затем обрабатывали, как указано выше. Оценку пролиферации Т-лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии. Установлено, что этап прекультивирования не влияет на относительное количество пролиферирующих Т-лимфоцитов. Вместе с тем в пробах с прекультивированными клетками было снижено число дочерних генераций, формируемых как CD4+, так и CD8+Т-лимфоцитами. Кроме того, выявлено значительное увеличение доли умирающих элементов среди вступивших в деление CD4+Т-клеток. При этом в пуле CD8+Т-лимфоцитов данного последствия этапа прекультивирования не было отмечено. Таким образом, прекультивирование клеток существенно увеличивает процент Т-лимфоцитов, гибнущих в процессе деления. Данный феномен был обнаружен только среди CD4+Т-клеток, что, по-видимому, отражает их большую чувствительность к гибели in vitro по сравнению с CD8+Т-лимфоцитами.

T lymphocytescryopreservationproliferationprecultivation (rest)flow cytometryТ-лимфоцитыкриоконсервацияпролиферацияпрекультивирование (отдых)проточная цитометрияМинистерство науки и высшего образования Российской ФедерацииMinistry of science and higher education of the Russian Federation075-03-2024-459Benczik M., Gaffen S.L. The interleukin (IL)-2 family cytokines: survival and proliferation signaling pathways in T lymphocytes. Immunol. Invest., 2004, Vol. 33, no. 2, pp. 109-142.Browne D.J., Miller C.M., Doolan D.L. Technical pitfalls when collecting, cryopreserving, thawing, and stimulating human T-cells. Front. Immunol., 2024, Vol. 15, 1382192. doi: 10.3389/fimmu.2024.1382192.Capelle C.M., Ciré S., Ammerlaan W., Konstantinou M., Balling R., Betsou F., Cosma A., Ollert M., Hefeng F.Q. Standard Peripheral blood mononuclear cell cryopreservation selectively decreases detection of nine clinically relevant T cell markers. Immunohorizons, 2021, Vol. 5, pp. 711-720.Li B., Yang C., Jia G., Liu Y., Wang N., Yang F., Su R., Shang Y., Han Y. Comprehensive evaluation of the effects of long-term cryopreservation on peripheral blood mononuclear cells using flow cytometry. BMC Immunol., 2022, Vol. 23, 30. doi: 10.1186/s12865-022-00505-4.Owen R.E., Sinclair E., Emu B., Heitman J.W., Hirschkorn D.F., Epling C.L., Tan Q.X., Custer B., Harris J.M., Jacobson M.A., McCune J.M., Martin J.N., Hecht F.M., Deeks S.G., Norris P.J. Loss of T cell responses following long-term cryopreservation. J. Immunol. Methods, 2007, Vol. 326, pp. 93-115.Santos R., Buying A., Sabri N., Yu J., Gringeri A., Bender J., Janetzki S., Pinilla C., Judkowski V.A. Improvement of IFNg ELISPOT performance following overnight resting of frozen PBMC samples confirmed through rigorous statistical analysis. Cells, 2014, Vol. 24, pp. 1-18.Sarkar S., Kalia V., Montelaro R.C. Caspase-mediated apoptosis and cell death of rhesus macaque CD4+ T-cells due to cryopreservation of peripheral blood mononuclear cells can be rescued by cytokine treatment after thawing. Cryobiology, 2003, Vol. 47, no. 1, pp. 44-58.Wang L., Hückelhoven A., Hong J., Jin N., Mani J., Chen B.A., Schmitt M., Schmitt A. Standardization of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells through a resting process for clinical immunomonitoring – Development of an algorithm. Cytometry A, 2016, Vol. 89, pp. 246-258.Zhang J., Yin Z., Liang Z., Bai Y., Zhang T., Yang J., Li X., Xue L. Impacts of cryopreservation on phenotype and functionality of mononuclear cells in peripheral blood and ascites. J. Transl. Intern. Med., 2024, Vol. 12, no. 1, pp. 51-63.