PhD, MD (Biology), Associate Professor, Head, Laboratory of Molecular Immunology
д.б.н., доцент, заведующая лабораторией молекулярной иммунологии
Intensive proliferation of T lymphocytes is essential for the development of both natural and vaccine-induced immunity. As a result, impaired T cell proliferation could influence disease susceptibility and vaccination effectiveness. A methodology enabling definition of dividing cells fraction, proliferation rate, as well as the cell cycle phases, would substantially enhance our understanding of the causes and mechanisms inderlying impaired T lymphocyte division. The aim of our study was to validate a novel approach for analyzing cell cycle of T lymphocytes at different maturation stages via flow cytometry. The study was performed with peripheral blood samples collected from healthy individuals. Peripheral blood mononuclear cells were isolated by density-gradient centrifugation, stimulated with phytohemagglutinin, and cultivated for 4 days under standard conditions (37 °C, 5% CO2). Activated leukocytes were labeled with the LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain and antibodies specific for CD3 BV605, CD4 PE, CD8 BV510, CCR7 PE/Cy7, and CD45RO APC-eF780. The fixed and permeabilized cells were further stained with antibodies targeting pRb AF488 and pHH3 AF647, along with the DAPI nuclear stain. Flow cytometric analysis was conducted using a CytoFLEX S instrument. The proposed technique allowed successful distinction between T lymphocytes in G0, G1, S, G2, and M phases of the cell cycle. Moreover, the designed fluorescence panel permits concurrent detection of CD4+ and CD8+T cells at diverse maturation states. During the pilot study, we have quantified the numbers of CD4+ and CD8+T lymphocytes progressing into active cell cycle phases, along with their phase-specific distributions. The differences in proliferation dynamics were also observed for naive CD4+ and CD8+T lymphocytes, central memory, effector memory, and terminal effector subsets. The proposed method enables comprehensive evaluation of the cell cycle progression in CD4+ and CD8+T lymphocytes across distinct maturation stages by means of flow cytometry.
Способность Т-лимфоцитов к интенсивной пролиферации является основой формирования как естественного, так и поствакцинального иммунитета. Соответственно, нарушение деления Т-клеток может отражаться на восприимчивости человека к заболеваниям и эффективности вакцинации. Подход, который позволит определять не только долю делящихся клеток и активность пролиферации, но и фазы клеточного цикла, значительно расширит возможности исследования причин и механизмов нарушения деления Т-лимфоцитов. Цель – апробировать новый подход к анализу клеточного цикла Т-лимфоцитов разной степени зрелости с использованием проточной цитометрии. Объектом исследования служила периферическая кровь, полученная от здоровых доноров. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли центрифугированием в градиенте плотности диаколла стандартным методом и стимулировали фитогемагглютинином, после чего культивировали в течение 4 суток (37 °С, 5% CO2). Активированные лейкоциты окрашивали витальным красителем LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain и антителами CD3 BV605, CD4 PE, CD8 BV510, CCR7 PE/Cy7 и CD45RO APC-eF780. Клетки фиксировали и пермеабилизировали, после чего окрашивали антителами к pRb AF488 и pHH3 AF647, а также красителем DAPI. Анализ клеток проводили на проточном цитометре CytoFLEX S. Установлено, что предложенный подход позволяет различать Т-лимфоциты, находящиеся в G0, G1, S, G2 и M-фазах клеточного цикла. Более того, разработанная панель флуоресцентных красителей и антител позволяет одновременно идентифицировать CD4+ и CD8+Т-клетки различной степени зрелости. Так, в пилотном исследовании было установлено количество CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов, вступивших в активные фазы клеточного цикла, и особенности их распределения по фазам. Также были выявлены отличия паттернов пролиферации наивных CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов, соответствующих клеток центральной и эффекторной памяти, а также терминальных эффекторов. Предложенный метод позволяет проводить комплексный анализ клеточного цикла CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов разной степени зрелости с использованием проточной цитометрии.