Junior Researcher, Laboratory of Molecular Immunology; Laboratory Assistant, Department of Microbiology and Immunology
младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии; лаборант кафедры микробиологии и иммунологии
Junior Researcher, Laboratory of Molecular Immunology; Engineer, Department of Microbiology and Immunology
младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии; инженер кафедры микробиологии и иммунологии
Metabolism is essential for proliferation and function of immune cells. Many enzymatic processes, primarily glycolysis and oxidative phosphorylation (OXPHOS), enable energy production and generate intermediates critical for synthesizing proteins, lipids, and nucleotides. Modern metabolic studies increasingly employ the Seahorse XF analyzer which measures extracellular acidification and oxygen consumption in real time, providing dynamic insights into glycolytic and OXPHOS rates. To assess these parameters, researchers typically use the Glycolytic Rate Assay Kit and Cell Mito Stress Test Kit. While these kits share some components, their simultaneous use for multi-pathway analysis is not standardized, resulting in increased labor, costs and sample requirements, as well as higher risks of data processing errors. The aim of this study was to evaluate the feasibility of combining these kits in order to measure glycolysis and OXPHOS in simultaneous mode using the Seahorse XF assay kits. Three experimental approaches were tested: 1) Glycolytic Rate Assay; 2) Cell Mito Stress Test; 3) combined protocol involving sequential addition of inhibitor solutions from both kits. Our experiments have shown that combining the tests does not affect the baseline measurements of glycolysis and OXPHOS. Other parameters, such as the maximum glycolytic and respiration rates, compensatory glycolysis, and reserved respiratory capacity, were also comparable to individual assay results in combined analyses. When combining the reagent components from Glycolytic Rate Assay Kit and Cell Mito Stress Test Kit, one may perform simultaneous analysis of a wide range of metabolic parameters in immune cells, ranging from baseline glycolysis and OXPHOS values to its peak values, as well as reserve glycolysis and OXPHOS capacities. This approach provides data quality while reducing the required sample material and minimizing processing errors. The use of a combined protocol creates an opportunity for in-depth studies of metabolic aspects of immune cell activation and proliferation as well as tumor cell biology.
Метаболизм играет ключевую роль в поддержании пролиферации и функций иммунных клеток. Множество ферментативных реакций, главными из которых являются гликолиз и окислительное фосфорилирование, позволяет клеткам производить энергию, а также необходимые компоненты для синтеза белков, липидов и нуклеотидов. Современным подходом в изучении процессов, связанных с метаболизмом клетки, является использование анализатора Seahorse XF, который в реальном времени измеряет уровень внеклеточного закисления и потребления кислорода. Это позволяет получить точную информацию о динамике гликолиза и окислительного фосфорилирования в исследуемых клетках. Для оценки этих параметров применяются тест-наборы Glycolytic Rate Assay Kit и Cell Mito Stress Test Kit, часть компонентов которых идентична. Тем не менее возможность одновременного использования компонентов этих тестов для исследования нескольких метаболических путей не предусмотрена, что приводит к увеличению трудоемкости и стоимости комплексных исследований, а также к повышенным требованиям к количеству биоматериала и риску ошибок при обработке данных. Цель работы – оценка возможности одновременного исследования гликолиза и окислительного фосфорилирования с использованием тест-наборов Seahorse XF. Были использованы три варианта тестов: 1) Glycolytic Rate Assay; 2) Cell Mito Stress Test; 3) комбинированный тест, подразумевающий последовательное внесение растворов ингибиторов из оригинальных тестов. Показано, что объединение тестов не влияет на фиксируемые на базальном уровне показатели гликолиза и окислительного фосфорилирования. Другие параметры, такие как максимальная скорость гликолиза и окислительного фосфорилирования, компенсаторный гликолиз и резервная дыхательная емкость митохондрий, в совместном исследовании также были сопоставимы со значениями отдельных тестов. Таким образом, совместное применение компонентов тест-наборов Glycolytic Rate Assay Kit и Cell Mito Stress Test Kit дает возможность одновременно изучать широкий диапазон метаболических показателей иммунных клеток, от базальных значений гликолитической и дыхательной активности до максимальных показателей и резервной емкости гликолиза и окислительного фосфорилирования. Это не приводит к потере качества получаемого результата, однако уменьшает количество необходимого биологического материала и погрешность при его обработке. Использование комбинированного подхода создаст возможность для глубокого изучения метаболических аспектов, связанных с активацией и пролиферацией как иммунных, так и опухолевых клеток.