Postgraduate Student, Junior Researcher, Department of Immunology, Laboratory of Cellular Interactions
аспирант, младший научный сотрудник отдела иммунологии, лаборатория клеточных взаимодействий
PhD (Biology), Researcher, Department of Immunology, Laboratory of Cellular Interactions
к.б.н., научный сотрудник отдела иммунологии, лаборатория клеточных взаимодействий
PhD (Biology), Researcher, Department of Immunology, Laboratory of Cellular Interactions
к.б.н., научный сотрудник отдела иммунологии, лаборатория клеточных взаимодействий
PhD, MD (Biology), Professor, Full Member, Russian Academy of Sciences, Chief Researcher, Department of Immunology, Laboratory of Molecular Immunology
д.б.н., профессор, академик РАН, главный научный сотрудник отдела иммунологии, лаборатория молекулярной иммунологии
PhD (Biology), Senior Researcher, Department of Immunology, Laboratory of Cellular Interactions
к.б.н., старший научный сотрудник отдела иммунологии, лаборатория клеточных взаимодействий
Targeting of adoptive immune cells is among modern approaches to therapy of solid tumors. Expression of an epidermal growth factor receptor HER2 is a common finding (20% of breast tumors) and is associated with a negative outcome. In this regard, obtaining HER2-specific effector cells carrying a chimeric CAR receptor is a relevant task. NK cells have a wide spectrum of activating receptors capable of recognizing tumor-associated markers and do not initiate a graft-versus-host reaction. The goal of this study was to obtain effector CAR-NK cells capable of eliminating the HER2-positive tumor targets. The NK cells were obtained by negative magnetic separation from peripheral mononuclear cells isolated from volunteers’ blood using density gradient centrifugation. Activated NK cells were modified by retroviral transduction. Preliminarily transfected Phoenix Ampho cells were used to accumulate retroviral particles carrying HER2- CAR construct. The DARPin 9-29-HER2 molecule with affinity for the HER2 distal domain I was used as the antigen-recognizing domain. The proportion of transduced NK cells was measured by means of GFP reporter protein expression. The surface emergence of HER2-CAR receptors was detected by expression of the c-Myc extracellular domain. All modified GFP+NK cells were capable of expressing HER2-CAR receptors on the cell membrane. Functional activity of HER2-CAR NK cells was measured using flow cytometry, by degranulation intensity and IFNγ production in the presence of HER2-positive target cells BT-474. To assess lytic activity of HER2-CAR NK cells, the cultures of HER2-CAR-expressing GFP+NK cells and unmodified GFP-NK cells were obtained by cell sorting. Lysis of BT-474 targets was measured by calcein release upon incubation with HER2-CAR and GFP- effectors. HER2-CAR NK cells were characterized by higher levels of degranulation and IFNγ production compared to GFP-NK cells. Moreover, HER2-CAR-NK cells had higher lytic activity towards BT-474. Thus, by means of genetic modification based on primary NK cells, we obtained highly effective HER2-CAR-NK agents capable of HER2-positive target recognition and possessing cytotoxic and cytokine-producing potential in presence of tumor cells. Expanding the variety of cellular effectors aimed at treating HER2-positive breast tumors will increase the potential of personalized tumor therapy in the future.
Таргетное воздействие адоптивными иммунными клетками – один из современных и активно развивающихся подходов к терапии солидных опухолей. Экспрессия рецептора эпидермального фактора роста HER2 свойственна для 20% опухолей молочной железы и сопряжена с негативным исходом заболевания. В связи с этим актуальной является задача по получению HER2-специфических клеточных эффекторов, несущих химерный рецептор CAR. NK-клетки, или натуральные киллеры, являются перспективной основой для создания противораковых эффекторов. Они обладают широким арсеналом активирующих рецепторов, способных распознавать опухоль-ассоциированные маркеры, а также, в отличие от T-клеток, не инициируют реакцию «трансплантат против хозяина». Целью данного исследования являлось получение CAR-NK-клеточных эффекторов, способных таргетно элиминировать HER2-позитивные опухолевые мишени. NK-клетки для последующих экспериментов были получены методом негативной магнитной сепарации из периферических мононуклеаров, выделенных из крови добровольцев посредством центрифугирования в градиенте плотности. Модификация NK-клеток, активированных IL-2 и фидерными клетками K562-mbIl21, проводилась методом ретровирусной трансдукции. Для накопления ретровирусных частиц, несущих конструкцию HER2-CAR, были использованы предварительно трансфицированные клетки Phoenix Ampho. В качестве антигенраспознающего домена была использована молекула DARPin 9-29-HER2, обладающая аффинностью к дистальному I домену HER2. Доля трансдуцированных NK-клеток оценивалась по экспрессии репортерного белка GFP, выход рецептора HER2-CAR на поверхность клеточной мембраны детектировался по экспрессии внеклеточного домена c-Myc. Функциональная активность полученных HER2-CAR-NK-клеток оценивалась методом проточной цитометрии по уровню дегрануляции и продукции IFNγ в присутствии HER2-позитивных мишеней BT-474. Чтобы оценить литическую активность HER2-CAR-NK-клеток, методом клеточной сортировки были получены культуры HER2-CAR экспрессирующих GFP+NK-клеток и немодифицированных GFP-NK-клеток. Лизис мишеней BT-474 оценивали по высвобождению кальцеина при инкубации с HER2-CAR и GFP- эффекторами. Все модифицированные GFP+NK-клетки были способны экспрессировать рецептор HER2-CAR на поверхности клеточной мембраны. HER2-CAR-NK-клетки отличались более высоким уровнем дегрануляции и продукции IFNγ по сравнению с GFP- нетрансдуцированными NK-клетками. Также несущие рецептор HER2-CAR NK-клетки обладали более высокой литической активностью в отношении BT-474. Таким образом, посредством генетической модификации на основе первичных NK-клеток нами были получены высокоэффективные агенты HER2-CAR-NK, способные таргетно распознавать HER2-позитивные опухолевые клетки и реализовывать в их присутствии цитотоксический и цитокинпродуцирующий потенциал. Расширение арсенала клеточных эффекторов, направленных на лечение HER2-позитивных опухолей молочной железы, позволит в перспективе увеличить потенциал персонифицированной терапии опухолей.