Russian Journal of ImmunologyRussian Journal of ImmunologyRussian Journal of Immunology1028-72212782-7291Russian Society of Immunology1724510.46235/1028-7221-17245-AOCSHORT COMMUNICATIONSКРАТКИЕ СООБЩЕНИЯShort CommunicationAnalysis of clonal NK cell populations using single-cell transcriptomics dataАнализ клональных популяций NK-клеток на основе данных single-cell транскриптомикиhttps://orcid.org/0000-0003-3378-6508UstiuzhaninaMaria O.УстюжанинаМария Олеговна
Russian Federation

Postgraduate Student, Department of Cellular and Melecular Biology, Center of Life Sciences, Junior Researcher, Department of Genomics of Adaptive Immunity, Laboratory of Immunosequencing Methods, Junior Researcher, Laboratory of Biomarkers, Institute of Translational Medicine

аспирант кафедры клеточной и молекулярной биологии Центр наук о жизни, младший научный сотрудник отдела геномики адаптивного иммунитета лаборатории методов иммуносеквенирования, младший научный сотрудник лаборатории биомаркеров института трансляционной медицины

mashaust1397@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-8119-8247KovalenkoElena I.КоваленкоЕлена Ивановна
Russian Federation

PhD (Biology), Senior Researcher, Department of Immunology, Laboratory of Cell Interactions

к.б.н., старший научный сотрудник отдела иммунологии лаборатории клеточных взаимодействий

lenkovalen@mail.ruShemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of SciencesФГБУН «Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наукSkolkovo Institute of Science and TechnologyАНОО ВО «Сколковский институт науки и технологий»Pirogov Russian National Research Medical UniversityФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения РФ23072025280920252848878922804202522062025Copyright ©; 2025, Ustiuzhanina M.O., Kovalenko E.I.Copyright ©; 2025, Устюжанина М.О., Коваленко Е.И.2025Ustiuzhanina M.O., Kovalenko E.I.Устюжанина М.О., Коваленко Е.И.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://rusimmun.ru/jour/article/view/17245

Natural killer (NK) cells represent a critical component of antiviral immunity, demonstrating remarkable adaptability during infections such as human cytomegalovirus (hCMV) and SARS-CoV-2. Recent advances in single-cell transcriptomics have revealed the clonally expanding NK cell populations with distinct functional profiles, blurring the traditional boundaries between innate and adaptive immunity. However, the functional heterogeneity and immunological significance of these clones remain incompletely understood. Our aim was to dissect clonal NK cell heterogeneity using published scRNA-seq datasets from hCMV-seropositive, seronegative, and COVID-19 patients, focusing on cluster-specific gene expression patterns. Our computational pipeline employed Seurat-based integration and high-resolution clustering of datasets from hCMV-seropositive (n = 5) and seronegative (n = 2) donors, along with COVID-19 patients (n = 2). We analyzed datasets using Seurat 5 in R. Quality-controlled data were normalized (SCTransform), integrated (batch-corrected), and clustered (UMAP). Differential gene expression (Wilcoxon test, log2FC > 0.25, p-adj < 0.05) and annotation were performed. In hCMV-seropositive individuals, we identified 12 transcriptionally distinct NK cell clusters exhibiting KLRC2 (NKG2C)-dependent organization, with specific clones showing either enhanced cytotoxic potential (marked by GZMB/GZMA upregulation), or unique inhibitory receptor profiles (variable KIR expression patterns). The hCMV-seronegative cohort displayed a simpler clonal structure with 9 clusters showing reduced KIR diversity but maintained distinct effector gene signatures. Analysis of COVID-19 patients revealed divergent clonal patterns: one patient showed reduced KLRC2 variability with prominent KLRC1 (NKG2A) expression, while another exhibited KIR heterogeneity without KLRC2 variation. Our analysis reveals distinct clonal NK cell populations in hCMV and COVID-19 contexts, characterized by divergent expression of activating and inhibitory receptors. These findings demonstrate infection-specific dynamics of clonal NK cell populations, highlighting their adaptive potential through differential receptor expression in antiviral responses.

Естественные киллеры (NK-клетки) являются ключевым компонентом противовирусного иммунитета, демонстрируя исключительную адаптивность при таких инфекциях, как цитомегаловирус человека (hCMV) и SARS-CoV-2. Современные методы single-cell транскриптомики выявили существование клональных популяций NK-клеток с уникальными функциональными профилями, что стирает традиционные границы между врожденным и адаптивным иммунитетом. Однако функциональная гетерогенность и иммунологическая значимость этих клонов остаются недостаточно изученными. Данное исследование направлено на анализ клональной гетерогенности NK-клеток с использованием опубликованных данных scRNA-seq от hCMV-серопозитивных, серонегативных доноров и пациентов с COVID-19, с акцентом на кластер-специфические паттерны экспрессии генов. В работе применялся вычислительный pipeline на основе Seurat для интеграции и кластеризации данных высокого разрешения от hCMV-серопозитивных (n = 5) и серонегативных (n = 2) доноров, а также пациентов с COVID-19 (n = 2). Данные анализировали в Seurat 5 (R) после контроля качества, нормализации (SCTransform), интеграции (коррекция batch-эффектов) и кластеризации (UMAP). Проводили анализ дифференциальной экспрессии генов (критерии: тест Вилкоксона, log2FC > 0,25, p-adj < 0,05) с последующей аннотацией. У hCMV-серопозитивных доноров выявлено 12 транскрипционно различных кластеров NK-клеток с KLRC2 (NKG2C)-зависимой организацией, где отдельные клоны демонстрировали либо повышенный цитотоксический потенциал (активация GZMB/GZMA), либо уникальные профили ингибиторных рецепторов (вариабельная экспрессия KIR). В серонегативной группе обнаружена более простая клональная структура (9 кластеров) с уменьшенным разнообразием KIR, но сохранением характерных эффекторных генетических сигнатур. У пациентов с COVID-19 выявлены различные клональные паттерны: у одного наблюдалась сниженная вариабельность KLRC2 при выраженной экспрессии KLRC1 (NKG2A), тогда как у другого отмечалась гетерогенность KIR без вариаций KLRC2. Наше исследование демонстрирует существование различных клональных популяций NK-клеток при hCMV-инфекции и COVID-19, характеризующихся дивергентной экспрессией активирующих и ингибиторных рецепторов. Полученные данные раскрывают инфекционно-специфическую динамику клональных популяций NK- клеток, подчеркивая их адаптивный потенциал через дифференциальную экспрессию рецепторов в противовирусных ответах.

NK cellsscRNAseqhCMVCOVID-19NKG2KIRNK-клеткиscRNAseqhCMVCOVID-19NKG2KIRRussian Science FoundationРоссийский научный фонд24-75-10136Béziat V., Liu L.L., Malmberg J.A., Ivarsson M.A., Sohlberg E., Björklund A.T., Retière C., Sverremark-Ekström E., Traherne J., Ljungman P., Schaffer M., Price D.A., Trowsdale J., Michaëlsson J., Ljunggren H.G., Malmberg KJ. NK cell responses to cytomegalovirus infection lead to stable imprints in the human KIR repertoire and involve activating KIRs. Blood, 2013, Vol. 121, no. 14, pp. 2678-2688.Grassmann S., Pachmayr L.O., Leube J., Mihatsch L., Andrae I., Flommersfeld S., Oduro J., Cicin-Sain L., Schiemann M., Flossdorf M., Buchholz V.R. Distinct surface expression of activating receptor Ly49H drives differential expansion of NK cell clones upon murine cytomegalovirus infection. Immunity, 2019, Vol. 50, no. 6, pp. 1391-1400.e4.Gumá M., Budt M., Sáez A., Brckalo T., Hengel H., Angulo A., López-Botet M. Expansion of CD94/NKG2C+ NK cells in response to human cytomegalovirus-infected fibroblasts. Blood, 2006, Vol. 107, no. 9, pp. 3624-3631.Ludwig L.S., Lareau C.A., Ulirsch J.C., Christian E., Muus C., Li L.H., Pelka K., Ge W., Oren Y., Brack A., Law T., Rodman C., Chen J.H., Boland G.M., Hacohen N., Rozenblatt-Rosen O., Aryee M.J., Buenrostro J.D., Regev A., Sankaran V.G. Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics. Cell, 2019, Vol. 176, no. 6, pp. 1325-1339.e22.Maucourant C., Filipovic I., Ponzetta A., Aleman S., Cornillet M., Hertwig L., Strunz B., Lentini A., Reinius B., Brownlie D., Cuapio A., Ask EH., Hull R.M., Haroun-Izquierdo A., Schaffer M., Klingström J., Folkesson E., Buggert M., Sandberg J.K., Eriksson L.I., Rooyackers O., Ljunggren H.G., Malmberg K.J., Michaëlsson J., Marquardt N., Hammer Q., Strålin K., Björkström NK. Natural killer cell immunotypes related to COVID-19 disease severity. Sci. Immunol., 2020, Vol. 5, no. 50, eabd6832. doi: 10.1126/sciimmunol.abd6832.Rückert T., Lareau C..A, Mashreghi M.F., Ludwig L.S., Romagnani C. Clonal expansion and epigenetic inheritance of long-lasting NK cell memory. Nat. Immunol., 2022, Vol. 23, no. 11, pp. 1551-1563.Ustiuzhanina M.O., Streltsova M.A., Timofeev N.D., Kryukov M.A., Chudakov D.M., Kovalenko E.I. Autologous T-cell-free antigen presentation system unveils hCMV-specific NK cell response. Cells, 2024, Vol. 13, no. 6, 530. doi: 10.3390/cells13060530.Ustiuzhanina M.O., Vavilova J.D., Boyko A.A., Streltsova M.A., Kust S.A., Kanevskiy L.M., Sapozhnikov A.M., Iskhakov R.N., Gubernatorova E.O., Drutskaya M.S., Bychinin M.V., Zhukova O.A., Novikova O.N., Sotnikova A.G., Yusubalieva G.M., Baklaushev V.P., Kovalenko E.I. Coordinated Loss and Acquisition of NK cell surface markers accompanied by generalized cytokine dysregulation in COVID-19. Int. J. Mol. Sci., 2023, Vol. 24, no. 3, 1996. doi: 10.3390/ijms24031996.Ustiuzhanina M.O., Boyko A.A., Vavilova J.D., Siniavin A.E., Streltsova M.A., Astrakhantseva I.V., Drutskaya M.S., Chudakov D.M., Kovalenko E.I. The Antigen-Specific Response of NK Cells to SARS-CoV-2 Correlates With KIR2DS4 Expression. J. Med. Virol., 2024, Vol. 96, no. 11, e70057. doi: 10.1002/jmv.70057.Varchetta S., Mele D., Oliviero B., Mantovani S., Ludovisi S., Cerino A., Bruno R., Castelli A., Mosconi M., Vecchia M., Roda S., Sachs M., Klersy C., Mondelli M.U. Unique immunological profile in patients with COVID-19. Cell. Mol. Immunol. 2021, Vol. 18, no. 3, pp. 604-612.Witkowski M., Tizian C., Ferreira-Gomes M., Niemeyer D., Jones T.C., Heinrich F., Frischbutter S., Angermair S., Hohnstein T., Mattiola I., Nawrath P., Mc Ewen S., Zocche S., Viviano E., Heinz G.A., Maurer M., Kölsch U., Chua R.L., Aschman T., Meisel C., Radke J., Sawitzki B., Roehmel J., Allers K., Moos V., Schneider T., Hanitsch L., Mall M.A., Conrad C., Radbruch H., Duerr CU., Trapani J.A., Marcenaro E., Kallinich T., Corman V.M., Kurth F., Sander L.E., Drosten C., Treskatsch S., Durek P., Kruglov A., Radbruch A., Mashreghi M.F., Diefenbach A. Untimely TGFβ responses in COVID-19 limit antiviral functions of NK cells. Nature, 2021, Vol. 600, no. 7888, pp. 295-301.