Russian Journal of ImmunologyRussian Journal of ImmunologyРоссийский иммунологический журнал1028-72212782-7291Russian Society of Immunology1725710.46235/1028-7221-17257-MAOSHORT COMMUNICATIONSКРАТКИЕ СООБЩЕНИЯShort CommunicationMethodological aspects of ex vivo-generated monocyte-derived microglia-like cells in children with autismМетодологические аспекты получения микроглия-подобных клеток из моноцитов периферической крови у детей с аутизмомhttps://orcid.org/0000-0001-5041-6440FilippovaYuliya Yu.ФилипповаЮлия Юрьевна
Russian Federation

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Professor, Department of Microbiology, Immunology and General Biology, Faculty of Biology

д.б.н., доцент, профессор кафедры микробиологии, иммунологии и общей биологии биологического факультета

julse@rambler.ruRusakovaKseniya A.РусаковаКсения Андреевна
Russian Federation

Postgraduate Student, Department of Microbiology, Immunology and General biology, Faculty of Biology

аспирант кафедры микробиологии, иммунологии и общей биологии биологического факультета

ksenya.antipina.97@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6462-9500BurmistrovaAlexandra L.БурмистроваАлександра Леонидовна
Russian Federation

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Department of Microbiology, Immunology and General Biology, Faculty of Biology

д.м.н., профессор, заведующая кафедрой микробиологии, иммунологии и общей биологии биологического факультета

burmal@csu.ruChelyabinsk State UniversityФГБОУ ВО «Челябинский государственный университет»22072025280920252849479523004202522062025Copyright ©; 2025, Filippova Y.Y., Rusakova K.A., Burmistrova A.L.Copyright ©; 2025, Филиппова Ю.Ю., Русакова К.А., Бурмистрова А.Л.2025Filippova Y.Y., Rusakova K.A., Burmistrova A.L.Филиппова Ю.Ю., Русакова К.А., Бурмистрова А.Л.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://rusimmun.ru/jour/article/view/17257

Current research findings suggest that dysregulation between the nervous and immune systems is a primary factor contributing to both initiation and progression of autism spectrum disorders (ASD). Microglia consists of resident brain immune cells playing a pivotal role in neuroinflammation and synaptic plasticity impairment. However, understanding these mechanisms has been limited by the lack of relevant experimental models. One promising approach involves microglia-like cells derived from peripheral blood monocytes (MDMi), which can serve as an effective model for studying human microglial function and developing personalized therapeutic strategies for neuropsychiatric diseases. The aim of our study was to optimize a protocol for generating sufficient quantities of microglia-like cells from peripheral blood monocytes of children with autism suitable for functional testing. Peripheral blood samples were collected from 18 children diagnosed with autism (mean age: 8.2 years; range: 6-12 years; 12 boys, 6 girls). Mononuclear cells were isolated using Ficoll density gradient centrifugation. After a 24-hour incubation period, adherent fractions enriched in monocytes were obtained via plate adherence. The monocytes were then cultured for either 10 or 14 days in serum-free RPMI-1640 medium supplemented with antibiotics and various cytokine cocktails to induce differentiation into MDMi. Viability was assessed using supravital staining with DAPI, while phenotyping was performed by flow cytometry targeting specific microglial markers such as P2RY12 and TMEM119. Statistical analyses were performed using PAST software version 4.03. Our findings demonstrate that successful induction of microglia-like cells requires, at least, a ten-day culture period with > 3 × 105 cells per well in RPMI-1640 medium containing stable glutamine, antibiotics, and a cocktail of three cytokines: GM-CSF, 10 ng/mL; IL-34, 100 ng/mL; IL-3, 10 ng/mL. Under these conditions, approximately 6 × 104 viable cells are generated, with over 90% expressing the microglial marker P2RY12. This cell population provides a valuable tool for studying ASD pathogenesis and identifying personalized treatment approaches.

Нарушения в согласованной работе нервной и иммунной систем в настоящее время признаются основными факторами инициации и прогрессии расстройств аутистического спектра (РАС). Ключевыми игроками в формировании нейровоспаления и нарушении синаптической пластичности выступают резидентные иммунные клетки мозга – микроглия. Исследования нейробиологических и нейроиммунологических механизмов, лежащих в основе РАС, ограничены отсутствием соответствующих экспериментальных моделей. В настоящее время одной из наиболее релевантных моделей для изучения функций микроглии человека и поиска персонифицированных терапевтических подходов к лечению нейропсихических заболеваний могут стать микроглия-подобные клетки, полученные из моноцитов периферической крови (MDMi). Цель работы – оптимизация протокола получения микроглия-подобных клеток из моноцитов периферической крови детей с аутизмом в количестве, достаточном для проведения функциональных тестов. Объектами исследования были мононуклеарные клетки периферической крови, полученные от 18 детей (12 мальчиков и 6 девочек; в возрасте 6-12 лет, средний возраст – 8,2 года) с диагнозом «ранний детский аутизм». Мононуклеары выделяли из периферической крови с помощью градиента плотности «Фиколл». Методом пластинчатой адгезии при 24-часовом культивировании из мононуклеаров получали фракцию моноцитов. Моноциты культивировали 10 или 14 суток в бессывороточной среде RPMI-1640 c добавлением антибиотиков и разных коктейлей цитокинов для их дальнейшей дифференцировки в MDMi. Количество жизнеспособных клеток оценивали с помощью суправитального красителя DAPI, а их фенотип определяли по наличию специфических маркеров микроглии – P2RY12 и TMEM119, методом проточной цитометрии. Для статистических расчетов использовали программное обеспечение PAST v. 4.03. В результате работы нами показано, что для индукции микроглия-подобных клеток из моноцитов периферической крови детей с аутизмом необходимо 10-дневное культивирование не менее 3 × 105 клеток/в лунке, в среде RPMI-1640 со стабильным глутамином, антибиотиками и коктейлем из трех цитокинов: GM-CSF (10 нг/мл), IL-34 (100 нг/мл), IL-3 (10 нг/мл). Такие параметры культивирования позволяют получить около 6 × 104 клеток, не менее 90% из которых экспрессируют на своей поверхности маркер микроглии – P2RY12+ и могут быть использованы в качестве модели для изучения механизмов патогенеза аутизма, а также поиска персонифицированных подходов к его лечению.

microglia-like cellsin vitro modelsIL-3autism spectrum disorderschildrenflow cytometryмикроглия-подобные клеткимодели in vitroIL-3расстройства аутистического спектрадетипроточная цитометрияРоссийский научный фондRussian Science Foundation24-25-20072Andoh M., Ikegaya Y., Koyama R. Microglia as possible therapeutic targets for autism spectrum disorders. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci., 2019, Vol. 167, pp. 223-245.Davit C.J., Hundley R.J., Bacic J.D., Hanson E.M. A pilot study to improve venipuncture compliance in children and adolescents with autism spectrum disorders. J. Dev. Behav. Pediatr., 2011, Vol. 32, no 7, pp. 521-525.Gebicke-Haerter P.J., Appel K., Taylor G.D., Schobert A., Rich I.N., Northoff H., Berger M. Rat microglial interleukin-3. J. Neuroimmunol., 1994, Vol. 50, no. 2, pp. 203-214.Heider J., Vogel S., Volkmer H., Breitmeyer R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. Int. J. Mol. Sci., 2021, Vol. 22, no. 19, 10254. doi: 10.3390/ijms221910254.Llaves-López A., Micoli E., Belmonte-Mateos C., Aguilar G., Alba C., Marsal A., Pulido-Salgado M., Rabaneda-Lombarte N., Solà C., Serratosa J., Vidal-Taboada J.M., Saura J. Human microglia-like cells differentiated from monocytes with GM-CSF and IL-34 show phagocytosis of α-synuclein aggregates and C/EBPβ-dependent proinflammatory activation. Mol. Neurobiol., 2025, Vol. 62, no 1, pp. 756-772.Ohgidani M., Kato T.A., Setoyama D., Sagata N., Hashimoto R., Shigenobu K., Yoshida T., Hayakawa K., Shimokawa N., Miura D., Utsumi H., Kanba S. Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease. Sci. Rep., 2014, Vol. 4, 4957. doi: 10.1038/srep04957.Quek H., Cuní-López C., Stewart R., Lim Y.C., Roberts T.L., White A.R. A robust approach to differentiate human monocyte-derived microglia from peripheral blood mononuclear cells. STAR Protoc., 2022, Vol. 3, no 4, 101747. doi: 10.1016/j.xpro.2022.101747.Sargeant T.J., Fourrier C. Human monocyte-derived microglia-like cell models: A review of the benefits, limitations and recommendations. Brain Behav. Immun., 2023, Vol. 107, pp. 98-109.