Astrakhantseva I.V., PhD (Biology), Senior Research Associate
Астраханцева И.В. – к.б.н., старший научный сотрудник
Gladkova L.S., Laboratory Assistant
Гладкова Л.С. – лаборант Института биологии и биомедицины
Vasilenko E.A., Lecturer
Василенко Е.А. – преподаватель Института биологии и биомедицины
Tarabykin V.S., PhD, MD (Biology), Professor, Head, Brain Development Genetics Laboratory Institute of Biology and Biomedicine
Director
Тарабыкин В.С. – д.б.н., профессор, заведующий лабораторией генетики развития мозга
директор
Drutskaya M.S., PhD (Biology), Leading Research Associate
Друцкая М.С. – к.б.н., ведущий научный сотрудник
Nedospasov S.A., PhD, MD (Biology), Professor, Full Member, Russian Academy of Sciences, Head, Laboratory of Molecular Mechanisms of Immunity
Head, Department of Immunology, Faculty of Biology
Head, Department
Недоспасов Сергей Артурович – д.б.н., академик РАН, профессор, заведующий лабораторией молекулярных механизмов иммунитета
заведующий кафедрой иммунологии биологического факультета
руководитель направления
119991, Москва, ул. Вавилова, 32. Тел.: 8 (499) 135-23-11
More than 40 years ago ethyl nitrosoеurea was identified as a powerful mutagen for mammalian germ cells resulting in random point mutations in gamete DNA. This feature allowed the use of this mutagen for genetic studies on the mechanisms of various pathological and physiological processes in model organisms. In our study genome-wide mutagenesis in C3H mice by ethyl nitrosourea followed in generation F3 by selection of animals resistant to acute lethal hepatotoxicity caused by a combination of E. coli lipopolysaccharide (LPS) and D-galactosamine (D-gal). Tumor necrosis factor (TNF) is known to be a critical mediator of this pathology. Exposure to D-galactosamine increases sensitivity of hepatocytes to TNF leading to their necrosis and/or apoptosis. After double LPS/D-gal screening in F3 several mice resistant to LPS/D-gal-induced hepatotoxicity were identified, and became the founders of the corresponding “mutant” families. Using outcrossing to C57BL6 background followed by intercrossing, generations F5 and F7 were obtained. Among families of mutant animals only one family showed the resistance to the combination of LPS and D-gal, but sensitivity to TNF-D-galactosamine. This phenotype showed approximately Mendelian inheritance consistent with the recessive mutation hypothesis. This latter fact was confirmed by the sensitivity of mice from “heterozygous generations” (F4 and F6) to lethal LPS/Dgal hepatotoxicity. Primary bone marrow macrophages obtained from half of the mutant mice showed significantly reduced levels of TNF after LPS stimulation in vitro. At the same time, the serum TNF levels 1 hour after the administration of a non-lethal LPS dose did not differ in the mutant family mice and wild-type mice. These results implicate a recessive mutation either in innate TLR4-mediated signaling pathway, including proteins associated with LPS transfer, adapter molecules, components of kinase signaling cascades, transcription factors, or in enzymes involved in regulation of TLR4 cascades, such as components of the ubiquitin cycle, or in genomic regulatory sequences that control the expression of one of these genes, including the tnf gene.
Более 40 лет назад было описано, что воздействие этилнитрозомочевины оказывает мощный мутагенный эффект на половые клетки млекопитающих. Этот химический мутаген приводит к появлению случайных точечных мутаций в ДНК гамет, что позволило использовать его для исследований генетики механизмов различных патологических и физиологических состояний на модельных организмах. В нашей работе после полногеномного мутагенеза этилнитрозомочевиной мышей линии С3Н в поколении F3 отбирали особей, показавших устойчивость к острой летальной гепатотоксичности, вызванной комбинацией липополисахарида (ЛПС) E. coli и Д-галактозамина (Д-гал). Известно, что облигатным медиатором этой патологии является фактор некроза опухоли (TNF). Воздействие Д-галактозамина повышает чувствительность гепатоцитов к действию TNF, что приводит к их некрозу и/или апоптозу. После двойного ЛПС/Д-гал-скрининга поколения F3 было выявлено несколько особей, устойчивых к воздействию ЛПС и Д-гал-гепатотоксичности, которые стали основателями «мутантных» семейств. С помощью аутбридинга на линию мышей C57BL6 с последующим возвратным скрещиванием последовательно были получены поколения F5 и F7. В поколении F5 было выявлено одно семейство мутантных животных, у которого устойчивость к комбинации ЛПС и Д-гал сочеталась с чувствительностью к комбинации TNF и Д-галактозамина, причем этот фенотип проявлял приблизительно менделевское расщепление, соответствующее гипотезе о рецессивной мутации. Этот факт подтверждался чувствительностью гетерозиготных поколений (F4 и F6) к летальной гепатотоксичности. Первичные макрофаги костного мозга, полученные из половины мутантных мышей с таким фенотипом, характеризовались значительно сниженными уровнями индуцированного TNF в ответ на стимуляцию ЛПС in vitro. С другой стороны, уровень TNF в сыворотке крови через 1 час после введения мышам нелетальной дозы ЛПС не отличался у мышей мутантного семейства и мышей дикого типа. Эти результаты могут быть объяснены рецессивной мутацией в одном из генов, кодирующих компоненты сигнальной цепочки врожденного иммунитета, затрагивающей TLR4 каскад, включая в себя белки, связанные с переносом ЛПС, адаптерные молекулы, компоненты киназных сигнальных каскадов и транскрипционные факторы, в ферментах, участвующих в регуляции TLR4 каскада, таких как компоненты убиквитинового цикла, либо в регуляторной последовательности генома, контролирующей экспрессию одного из этих генов, включая ген tnf.