Role of minor lymphocyte populations in development of liver fibrosis in children with glycogen storage disease

Olga V. Kurbatova; Курбатова Ольга Владимировна; Svetlana V. Petrichuk; Петричук Светлана Валентиновна; Goar B. Movsisyan; Мовсисян Гоар Борисовна; Daria G. Kuptsova; Купцова Дарья Геннадьевна; T. V. Radygina; Радыгина Татьяна Вячеславовна; A. O. Anushenko; Анушенко Антон Олегович; Elena L. Semikina; Семикина Елена Леонидовна; A. S. Potapov; Потапов Александр Сергеевич

doi:10.46235/1028-7221-10013-ROM

Роль малых популяций лимфоцитов при формировании фиброза печени у детей с гликогеновой болезнью

Авторы: Курбатова О.В.¹, Петричук С.В.¹, Мовсисян Г.Б.¹, Купцова Д.Г.¹, Радыгина Т.В.¹, Анушенко А.О.¹, Семикина Е.Л.¹^,2, Потапов А.С.¹^,2
Учреждения:
1. ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей» Министерства здравоохранения РФ
2. ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский университет)
Выпуск: Том 26, № 3 (2023)
Страницы: 337-344
Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Дата подачи: 15.05.2023
Дата принятия к публикации: 29.06.2023
Дата публикации: 11.08.2023
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/10013
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-10013-ROM
ID: 10013

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Гликогеновая болезнь (ГБ) – орфанное заболевание из группы наследственных болезней обмена веществ, приводящей к накоплению гликогена в печени и мышцах. Нарушение регуляции метаболизма гликогена в печени приводит к развитию фибротических изменений печени. В процессах фиброза печени при различных болезнях накопления ключевая роль отводится иммунной системе. Цель работы: оценить содержание малых популяций лимфоцитов и их соотношения у детей с печеночными формами гликогеновой болезни в зависимости стадии фиброза печени. Обследовано 148 детей с печеночными формами ГБ в возрасте Ме=7,7 [3,9; 11,8]. Группу сравнения составили 54 здоровых ребенка, сопоставимых по возрасту. Оценку стадии фиброза печени проводили на аппарате FibroScan F502 (EchoSence, Франция). Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили на цитофлуориметре CYTOMICS FC500 (Beckman Coulter, США). Показатели популяций лимфоцитов были проанализированы в процентах отклонения от возрастной нормы. У детей с ГБ выявлено увеличение степени фиброза печени от возраста (R=0,57). Содержание Treg у детей с ГБ было на нижней границе возрастной нормы и не зависело от стадии фиброза печени. Содержание Th17 и Thact лимфоцитов было значимо выше показателей группы сравнения при всех стадиях фиброза печени, начиная со стадии F1. С увеличением стадии фиброза печени отмечено повышение доли пациентов с содержанием Thact и Th17, превышающих верхнюю границу нормативных значений (PF0-F4=0,021 и PF0-F4=0,012, соответственно). Выявлено увеличение соотношений Th17/Treg и Thact/Treg у пациентов с ГБ относительно группы сравнения во всех возрастных группах, динамика соотношений Th17/Treg и Thact/Treg характеризовалась их увеличением с возрастом. Анализ показателей в зависимости от стадии фиброза печени у детей с ГБ выявил значимое увеличение соотношения Thact/Treg от стадии F0 к стадиям F1, F2, F3 и F4 (PF0-F4=0,000). Индекс Th17/Treg также увеличивался от стадии F0 к стадиям F1, F2, F3 (PF0-F3=0,000).

Повышение содержания Thact и Th17 лимфоцитов, а также индексов Th17/Treg и Thact/Treg с увеличением стадии фиброза печени можно использовать как дополнительный инструмент в оценке фибротических изменений печени. Иммунологические показатели объективно отражают степень тяжести состояния пациента с печеночными формами ГБ.

Ключевые слова

дети, гликогеновая болезнь, фиброз печени, лимфоциты, проточная цитометрия, Thact/Treg, Th17/Treg

Полный текст

Введение

Врожденные нарушения обмена веществ могут проявляться в любом возрасте, и постановка диагноза при редких болезнях затруднена, поскольку они могут имитировать более распространенные состояния [13].

Болезни накопления гликогена (ГБ) с поражением печени классифицируют на типы 0, I, III, IV, VI, IX и XI в зависимости от пораженного фермента. Гипогликемия и гепатомегалия являются отличительными признаками заболевания, реже выявляются поражения мышц, почечных канальцев, дислипидемия и остеопения [9]. Распространенность ГБ составляет 1:20 000 [14].

Диагноз «ГБ» ставится на основании клинических проявлений и результатов лабораторных исследований, но часто необходим молекулярно-генетический анализ [9]. Биопсия печени – золотой стандарт оценки фибротических изменений печени, является также и методом диагностики ГБ, однако данная процедура носит высоко инвазивный характер [8].

Гликоген – основная форма запасания глюкозы и основной источник неокисленной глюкозы для скелетных мышц и печени, необходим для поддержания нормального уровня глюкозы в крови. Основными ферментами, участвующими в расщеплении гликогена, являются гликогенфосфорилаза и фермент деветвления. Дефицит любого из этих ферментов проявляется в виде болезней накопления гликогена, включая болезнь фон Гирке (тип I), болезнь Кори (тип III) и болезнь Герса (тип VI, IX) [10].

Печень является основным хранилищем гликогена и играет важную роль в поддержании системного гомеостаза глюкозы. Молекулярный механизм заболеваний печени, связанных с аномальным накоплением гликогена, активно изучается [12]. Нарушение регуляции метаболизма гликогена в печени часто приводит к компенсаторному увеличению липолиза из внепеченочных источников и митохондриальному окислению жирных кислот при типах 0, III, VI, IX и XI ГБ, что способствует развитию фибротических изменений печени, вплоть до цирроза [6].

Описаны иммунные нарушения у пациентов с ГБ, включая нейтропении, врожденные и адаптивные компартменты, в том числе неспособность популяций активированных иммунных клеток и регуляторных Т-клеток подвергаться соответствующему переключению на гликолитический метаболизм при гипогликемических состояниях и выполнять свои функции [7].

Показана вовлеченность иммунной системы в процесс фиброза печени при различных болезнях накопления, аутоиммунных и вирусных гепатитах, неалкогольной жировой дистрофии печени [3, 11].

Подробно изучена возрастная динамика показателей иммунного статуса у детей с печеночными формами ГБ: показано увеличение относительного количества Т-хелперов и снижение цитотоксических Т-лимфоцитов. В составе Т-хелперов выявлено увеличение доли активированных клеток и существенное нарастание доли популяции Тh17-лимфоцитов, которые сопровождались увеличением степени биохимических нарушений [4]. Однако неясным остается вопрос о роли малых популяций лимфоцитов в развитии фибротических изменений в печени у детей с ГБ.

Цель работы – оценить содержание малых популяций лимфоцитов и их соотношения у детей с печеночными формами гликогеновой болезни в зависимости от стадии фиброза печени.

Материалы и методы

Обследовано 148 детей с печеночными формами ГБ (I/III/VI/IX типы) в возрасте от 1 до 17,8 лет, Ме = 7,7 (3,9-11,8). Группу сравнения составили 54 здоровых ребенка, сопоставимых по возрасту.

Оценку стадии фиброза печени проводили методом транзиентной эластографии печени на аппарате FibroScan F502 (EchoSens, Франция). Для диагностики степени фиброза печени использовали шкалу METAVIR: стадия F1 – плотность в интервале 5,9-7,2 кПа; стадия F2 – 7,3-9,5 кПа; стадия F3 – 9,6-12,5 кПа, стадия F4 (цирроз печени) – плотность 12,6 кПа и более [2].

Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили на проточном цитофлуориметре CYTOMICS FC500 (Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных антител, меченных флуорохромами: CD3-PC-5, CD4-FITC, CD127-PE, CD161-PE, CD25 PE-Cy7, CD45-PerCP, CD45-PC7 (Beckman Coulter, США). В регионе CD45⁺ исследовали следующие популяции клеток: CD3⁺CD161⁺CD4⁺ (Th17-лимфоциты); CD4⁺CD25⁺CD127^high (активированные Т-хелперы – Thact); CD4⁺CD25⁺CD127^low (регуляторные Т-лимфоциты – Treg).

Учитывая известную возрастную динамику показателей клеточного иммунитета, обследованные дети были разделены на группы согласно возрасту: 1-2 года (n = 12), 2-5 лет (n = 47), 6-8 лет (n = 24), 9-11 лет (n = 31) и старше 12 лет (n = 34) [1, 5]. Показатели субпопуляций лимфоцитов были проанализированы в процентах отклонения от возрастной нормы для исключения влияния возрастных особенностей. Формула расчета отклонений:

$X n = \frac{X_{m i n} - X}{0, 01 \cdot (X_{m a x} - X_{m i n})}$ , где

X_n – значение индивидуального показателя, нормированное на возрастную норму; X – значение изучаемого показателя; X_max – верхняя граница возрастной нормы; X_min – нижняя граница возрастной нормы. Диапазон возрастной нормы принимали за 100%.

Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи пакета Statistica 10.0. (StatSoft, США). Описательная статистика представлена в виде Me (Q₀_,₂₅_-Q₀_,₇₅). Для оценки значимости различий между группами использовали непараметрический критерий Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

При анализе степени фиброза печени (по шкале METAVIR) дети с ГБ были разделены на группы: группа 1 – отсутствие фиброза печени F0 (n = 66, 45%); группа 2 – минимальный фиброз F1 (n = 31, 21%); группа 3 – умеренный фиброз F2 (n = 24, 16%), группа 4 – выраженный фиброз печени F3 (n = 16, 11%) и группа 5 – цирроз печени F4 (n = 11, 7%). Корреляционный анализ степени фиброза печени и возраста пациентов показал, что с увеличением возраста пациентов возрастает вероятность развития фиброза печени (R = 0,57). Однако необходимо отметить, что у части пациентов с ГБ цирроз (F4) был выявлен уже к возрасту 4-5 лет, наряду с выявлением пациентов, у которых было зарегистрировано отсутствие фибротических изменений печени в возрасте старше 12 лет.

Рисунок 1. Содержание Treg (А), Thact (Б), Treg (B) клеток (% от СD4) у детей с гликогеновой болезнью в зависимости от стадии фиброза печени в процентах от возрастных нормативных значений

Примечание. Диапазон нормативных значений нанесен пунктирной линией, под рисунками приведены достоверные отличия между группами.

Figure 1. The content of Treg (A), Thact (B), Treg (C) cells (% of CD4) in children with glycogen disease, depending on the stage of liver fibrosis, as a percentage of age normative values

Note. The range of normative values is marked with a dotted line, reliable differences between groups are shown below the figures.

Анализ содержания Treg-клеток (% от СD4) у детей с ГБ показал, что в 50% случаев их количество соответствовало возрастной норме, в 42% случаев было снижено и только у 8% процентов пациентов было повышено относительно группы сравнения. Повышение Treg было выявлено только на стадиях фиброза F0-F1. Несмотря на то, что содержание Treg у детей с ГБ находилось на уровне нижней границы нормативных показателей или ниже, в целом по группе достоверных отличий от группы сравнения выявлено не было, вне зависимости от стадии фиброза печени (рис. 1А).

В отличие от Treg, содержание Th17-лимфоцитов и Thact было достоверно выше показателей группы сравнения при всех стадиях фиброза печени, начиная со стадии F1 (рис. 1Б, В). Данный факт свидетельствует о преобладании эффекторных и аутоагрессивных клеток над регуляторными, что согласуется с общепризнанной концепцией о нарушении баланса субпопуляций лимфоцитов и их ключевой роли в поддержании воспалительного процесса в тканях и органах [11].

У 54% детей с ГБ содержание Thact было выше показателей возрастных референсных значений. С увеличением стадии фиброза печени было выявлено повышение доли пациентов с содержанием Thact, превышающих верхнюю границу нормативных значений (P_F₀_-_F₁ = 0,049, P_F₀_-_F₄ = 0,021, рис. 1Б).

Содержание Th17-лимфоциты у детей с ГБ было выше относительно группы сравнения в 70% случаев. С увеличением стадии фиброза печени содержание Th17-лимфоцитов достоверно росло (P_F₀_-_F₄ = 0,012, рис. 1В). На стадии F0 содержание клеток этой популяции относительно группы сравнения было выше только у половины пациентов, а к стадии F4 – у всех детей превышало нормативные показатели в 2 раза и более (рис. 1В).

Таким образом, динамическое наблюдение за показателями малых популяций лимфоцитов можно использовать в качестве маркера степени тяжести фибротических изменений печени у детей с ГБ.

Анализ возрастной динамики соотношений Th17/Treg и Thact/Treg показал увеличение данных индексов с возрастом как у детей с ГБ, так и в группе сравнения (рис. 2А, В).

Выявлено увеличение соотношений Th17/Treg и Thact/Treg у пациентов с ГБ относительно группы сравнения у детей всех возрастных групп (рис. 2 А, Б).

Рисунок 2. Динамика изменений соотношения Th17/Treg (А) и Thact/Treg (Б) с возрастом у детей с ГБ и в группе сравнения, изменение индексов Th17/Treg и Thact/Treg в зависимости от стадии фиброза печени (В)

Figure 2. Dynamics of changes in the ratio of Th17/Treg (A) and Thact/Treg (B) with age in children with GSD and in the comparison group, changes in the indices of Th17/Treg and Thact/Treg depending on the stage of liver fibrosis (C)

У здоровых детей индекс Th17/Treg достоверно увеличивался с возрастом (P₀_-₅ = 0,000) и у детей старше 12 лет не превышал Ме = 2,5 (1,99-2,69). У детей с ГБ данное значение было выше уже в возрасте 6-8 лет, Ме = 2,72 (1,81-3,15) (3-я возрастная группа), а к возрасту 12 лет значение данного показателя составило Ме = 4,24 (3,04-4,97), что в 2 раза превышало показатель группы сравнения (рис. 2А).

Соотношение Thact/Treg в группе сравнения достоверно увеличивалось с возрастом (P₀_-₅ = 0,000), в возрастной группе старше 12 лет соотношение составило Ме = 1,6 (1,31-2,12). У детей с ГБ данный показатель характеризовался большим разбросом данных, и в возрастной группе старше 12 лет составил Ме = 2,22 (1,68-2,78) (рис. 2Б).

Анализ показателей в зависимости от стадии фиброза печени у детей с ГБ выявил значимое увеличение соотношения Thact/Treg от стадии F0 к стадиям F1, F2, F3 и F4 (P_F₀_-_F₄ = 0,000) (рис. 2В). Индекс Th17/Treg также увеличивался от стадии F0 к стадиям F1, F2, F3 (P_F₀_-_F₃ = 0,000). Из-за большого разброса показателей на стадии F3 отмечена лишь тенденция к снижению данного показателя к стадии F4, что требует дальнейшего изучения. По всей видимости, на изменение данного соотношения больше влияет наличие фиброза в печени, чем возраст пациента. В связи с выявленной линейной зависимостью соотношение Thact/Treg от стадии фиброза печени, можно рекомендовать использование этого индекса для мониторинга фибротических изменений у детей с ГБ.

Заключение

Таким образом, повышение содержания Thact и Th17-лимфоцитов, а также индексов Th17/Treg и Thact/Treg с увеличением стадии фиброза печени можно использовать как дополнительный инструмент в оценке стадии фиброза печени. Иммунологические показатели объективно отражают степень тяжести состояния пациента с печеночными формами гликогеновой болезни.