Визуализация в10-регуляторных клеток в периферической крови при физиологической беременности

Актуальным трендом в исследованиях В-клеточного звена иммунной системы является изучение малых субпопуляций. Установлено, что минорная субпопуляция IL-10 продуцирующих В-клеток (B10-reg клетки) обладает свойствами ограничивать избыточные реакции врожденного и адаптивного иммунного ответа. Показан их регуляторный и патогенетический эффект при различных физиологических и патофизиологических состояниях, в частности при патологии беременности.

Вследствие низкого содержания ВЮ-reg клеток в крови (до 1%) и сложностей визуализации данных проточной цитометрии, разработанный ранее метод, основанный на продолжительной стимуляции клеток периферической крови коктейлем факторов ((CD40L + CpG) и РМА), вызывающих активацию, пролиферацию и созревание клеток, позволяет визуализировать обогащенную фракцию ВЮ-reg клеток (В10-клетки + про-В10-клетки), содержание которой превышает 5%. Целью данного исследования явилось получение стимулированной ex vivo популяции В10-клеток + про-В10-клеток из периферической крови пациенток с физиологической беременностью и разработка оптимальной стратегии гейтирования ВЮ-reg клеток для их визуализации.

У пациенток с физиологической беременностью в III триместре осуществляли забор периферической крови. Проводилась стимуляция клеток по двум протоколам. Первый протокол: короткая (5 часов) стимуляция клеток цельной крови в стерильных условиях коктейлем PMA + иономицин + брефельдин А. Второй протокол: продолжительная (48 часов) стимуляция выделенной мононуклеар-ной фракции в стерильных условиях коктейлем (CD40L + CpG) с добавлением в последние 5 часов РМА + иономицин + брефельдин А. Проводилось окрашивание клеток на поверхностные маркеры (CD45, CD19, CD24, CD27, CD38) и внутриклеточное содержание IL-10. Анализ образцов выполняли на проточном цитометре Navios™.

Проведен пятицветный цитометрический анализ и разработана стратегия последовательного гейтирования, основанная на выделении гейта по лимфоцитам (маркер CD45); ограничении В-лимфоцитов (маркер CD19); выделении субпопуляции В-клеток, экспрессирующих маркер CD24; ограничении двух искомых субпопуляций В10-reg клеток по CD27 и CD38: CD19⁺CD24^hiCD27⁺IL-10⁺ и CD19⁺CD24^hiCD38^hiIL-10⁺. Стимуляция клеток по первому протоколу позволяет визуализировать до 1% обеих субпопуляций, по второму около — 10%. Метод открывает перспективы фундаментальных исследований B10-reg клеток при беременности. Детектируемые количества обогащенной популяции B10-reg клеток могут иметь диагностическое и прогностическое значение в клинике при идиопатических акушерских осложнениях.