Уровень противовоспалительных цитокинов в супернатантах культур клеток периферической крови у детей с аутоиммунными и инфекционными заболеваниями

Полный текст

Работа выполнена в рамках госзадания ИИФ УрО РАН (№ гос. регистрации AAAA-F21-121012090091-6, тема «Иммунная система в регуляции физиологических функций в норме и при патологических процессах»).

Введение

Цитокины (ЦК) – обширное семейство сигнальных полипептидных молекул, которые синтезируются клетками иммунной системы и других тканей: эпителия, эндотелия, соединительной ткани и т.д. [4]. ЦК регулируют процессы пролиферации, созревания клеток, их эффекторные функции. Им принадлежит значительная роль в иммунном ответе при внедрении различных патогенов, а также в формировании многих неинфекционных заболеваний, включая онкологические, аутоиммунные и аллергические [7]. Для развития воспалительного процесса любой этиологии важно соотношение про- и противовоспалительных ЦК. Последние осуществляют контроль за эффектами провоспалительных ЦК: способны подавлять транскрипцию их генов в клетках-продуцентах, индуцировать синтез рецепторных антагонистов, усиливать образование растворимых рецепторов и снижать плотность мембранных рецепторов провоспалительных цитокинов [4, 7].

В число наиболее значимых противовоспалительных ЦК входят IL-1rа, IL-4, IL-10. IL-1rа – естественный антагонист IL-1, синтезируется моноцитами и макрофагами, Т- и В-лимфоцитами, нейтрофилами, фибробластами, эндотелиальными клетками, гепатоцитами. IL-1rа всегда присутствует в сыворотке крови, для предотвращения негативных последствий системного действия IL-1 [9]. IL-10 продуцируется Т-лимфоцитами, преимущественно Т-хелперами 2-го типа, моноцитами. Противовоспалительный эффект IL-10 реализуется через подавление активности макрофагов и Т-лимфоцитов – прежде всего синтеза этими клетками IL-1, IL-6, IFNγ, TNFα [4]. IL-4 синтезируется Т-хелперами 2-го типа и, подобно IL-10, способен ингибировать продукцию IL-1, IL-6, TNFα и IFNγ, при этом IL-4 активирует В-лимфоциты, индуцирует выработку иммуноглобулина класса Е [4].

Исследованию уровня ЦК в сыворотке или плазме крови при различных заболеваниях посвящено большое количество публикаций. Однако уровни ЦК в циркуляции могут быть крайне низкими, т.к. они являются короткоживущими молекулами, могут накапливаться в основном в очаге воспаления, в крови могут присутствовать растворимые рецепторы ЦК, антицитокиновые антитела и антагонисты рецепторов [10].

Альтернативой исследованию ЦК в естественных биологических жидкостях может служить определение их концентрации в культуральной среде при инкубировании клеток периферической крови in vitro. Использование различных специфических и неспецифических стимуляторов позволяет оценить уровень исходной активации клеток, способность реагировать на индукцию, наличие функциональных резервов [3]. В качестве неспецифических стимуляторов чаще используют растительные митогенные лектины, в том числе фитогемагглютинин (ФГА) [4]. Определение секреции ЦК клетками крови может быть особо интересно при различной хронической патологии, при которой не всегда наблюдаются повышенные концентрации этих белков в сыворотке и плазме крови.

В связи с этим целью нашей работы явилось определение уровня спонтанной и стимулированной продукции противовоспалительных цитокинов в супернатантах клеточных культур цельной крови у детей с аутоиммунными и инфекционными заболеваниями.

Материалы и методы

Обследованы дети и подростки от 2 до 17 лет. В наших предварительных исследованиях не выявлено взаимосвязи концентрации ЦК с возрастом детей. В связи с этим дети разного возраста объединены в пределах групп с разными диагнозами. Группы: ювенильный идиопатический артрит (ЮИА, n = 101); неуточненная реактивная артропатия (нРеА, n = 24); системная красная волчанка (СКВ, n = 14); хронический вирусный гепатит С (ХВГС, n = 24); условно здоровые дети (УЗД, n = 33). ЮИА является гетерогенным заболеванием и включает в себя несколько патогенетически различных вариантов [1]. Однако нами не выявлено различий между вариантами течения ЮИА по уровню спонтанной и стимулированной секреции противовоспалительных ЦК [5]. На этом основании пациенты с ЮИА объединены в одну группу.

Дети с СКВ, ЮИА и нРеА проходили обследование и лечение у детских ревматологов консультативной поликлиники, дети с ХВГС были госпитализированы в гастроэнтерологическое отделение ГАУЗ СО «ОДКБ». Диагноз «ЮИА» устанавливался на основании критериев ILAR (Международной лиги ревматологических ассоциаций второго пересмотра в Edmonton, 2001); диагноз «СКВ» – в соответствии с критериями Американского колледжа ревматологов (ACR, 1997); критерии нРеА: множественные поражения суставов с высокой степенью активности; затяжное течение заболевания до 1 года или рецидивирующее течение (суставная атака 1-2 раза в год); отсутствие хронологической связи с инфекционными заболеваниями. Все дети с ревматическими заболеваниями и из контрольной группы не имели признаков острого или хронического инфекционного процесса на момент обследования. Критерием постановки диагноза «ХВГС» являлось обнаружение возбудителя и определение вирусной нагрузки.

Кровь забирали в вакуумные пробирки (Greiner, Австрия) с антикоагулянтом (гепарин). Образцы крови разводили глутаминсодержащей средой RPMI-1640 («ПанЭко», Россия), в соотношении 1:9, готовили 2 образца: контрольный образец без стимулятора; образец, стимулированный фитогемагглютинином (ФГА, Sigma) в конечной концентрации 20 мкг/мл. Образцы разведенной крови инкубировали (37 °С, 5% СО₂) в течение 24 часов. Супернатанты клеточных культур (СКК) разливали на аликвоты и однократно замораживали для хранения. Определение концентрации IL-1ra, IL-4, IL-10 в СКК проводили методом ИФА с использованием диагностических наборов фирмы «Вектор-Бест» (Россия).

Для оценки значимости различий между независимыми группами использовали непараметрический критерий Манна–Уитни. Статистическая обработка выполнена с использованием программы Statistica для Windows (версия 6.0 StatSoftInc).

Результаты

При исследовании спонтанной продукции IL-1rа, IL-4 и IL-10 выявлено, что их выработка клетками крови у пациентов с ЮИА оставалась на уровне контрольной (табл. 1). У больных с нРеА уровень IL-4 в супернатантах культур клеток крови также не отличался от контрольных значений, а продукция IL-1rа и IL-10 была выше, по сравнению со здоровыми детьми. Спонтанный уровень IL-4 у детей с СКВ и ХВГС был значительно ниже, чем в контрольной группе, концентрации IL-1rа и IL-10 не отличались от таковых в группе УЗД.

Инкубация клеток крови с фитогемагглютинином в течение 24 часов приводила к существенному усилению синтеза ЦК в каждой группе по сравнению с интактными клетками (табл. 1). У детей с ЮИА, нРеА и ХВГС выявлено снижение стимулированной концентрации IL-1ra в культуральной жидкости по сравнению со здоровыми детьми. Различий по продукции этого ЦК между группами детей с СКВ и УЗД выявлено не было. Обнаружено снижение ФГА-индуцированной продукции IL-4 у больных с СКВ и ХВГС по сравнению со здоровыми детьми. Больные с ЮИА и нРеА не отличались от детей контрольной группы по данному параметру (табл. 1). Индуцированная выработка IL-10 клетками крови в исследованных группах не различалась (табл. 1).

 

Таблица 1. Концентрация IL-1ra, IL-4 и IL-10 в супернатантах клеточных культур у детей с ЮИА, НРЕА, СКВ, ХВГС и условно здоровых детей, me (q_0,25-q_0,75)

Table 1. Concentration of IL-1ra, IL-4 and IL-10 in supernatants of blood cell cultures in children with jia, NREA, SLE, CVHC and in healthy children, me (q_0.25-q_0.75)

Диагноз Diagnosis	Вариант инкубации Option of incubation	Цитокин, пг/мл Cytokines, pg/ml
		IL-1ra	IL-4	IL-10
СКВ SLE (n = 14)	Спонтанный Spontaneous	373,0 (169,0-1042,0)	2,0* (1,0-3,0)	3,5 (1,0-5,0)
	ФГА PHA	2789,0 (1695,0-3552,0)	6,0** (2,0-8,0)	73,0 (54,0-398,0)
ЮИА JIA (n = 101)	Спонтанный Spontaneous	505,0 (242,0-970,0)	3,0 (2,0-5,0)	1,0 (0,0-3,0)
	ФГА PHA	2637,0* (1829,0-3475,0)	11,0 (8,0-15,0)	255,0 (158,0-378,0)
нРеА nReA (n = 24)	Спонтанный Spontaneous	718,0* (341,0-1009,0)	5,0 (2,0-6,0)	5,5* (0,1-41,0)
	ФГА PHA	2001,0*** (1261,0-2797,0)	12,0 (7,0-15,0)	335,0 (177,0-447,0)
ХВГС CVHC (n = 24)	Спонтанный Spontaneous	592,0 (355,0-942,0)	1,0* (0,0-4,0)	1,0 (1,0-2,0)
	ФГА PHA	2901,0* (2542,0-3119,0)	7,0** (2,5-12,5)	339,0 (231,0-448,0)
Условно здоровые дети Healthy children (n = 33)	Спонтанный Spontaneous	508,0 (215,0-703,0)	4,0 (2,0-5,0)	1,5 (0,0-4,0)
	ФГА PHA	3363,0 (2432,0-4280,0)	13,0 (8,0-19,0)	276,0 (174,0-341,0)

Примечание. Различия с группой условно здоровых детей: * – р < 0,05; ** – р < 0,01; *** – р < 0,001.

Note. Differences with healthy children: *, р < 0.05; **, р < 0.01; ***, р < 0.001.

 

Обсуждение

Спонтанная продукция противоспалительных цитокинов IL-1rа, IL-4 и IL-10 клетками крови у пациентов с ЮИА не отличалась от таковой у здоровых детей (табл. 1). Отсутствие различий по выработке IL-4 и IL-10 соотносится с данными ряда авторов, получивших аналогичные результаты [12, 18]. Однако в исследованиях S. Raziuddin и соавт. показано, что клетки периферической крови интенсивнее продуцировали IL-4 и IL-10 в отсутствие стимулятора у больных с различными вариантами ЮИА, по сравнению с контролем [20].

Нами было выявлено снижение стимулированной продукции IL-1rа в группе с ЮИА по сравнению с контролем, концентрации двух других ЦК не различались. Аналогичные результаты получены Mller K. и соавт. при использовании в качестве стимуляторов фитогемагглютинина и липополисахарида [18]. Однако в другой работе сообщается, что стимулированная форбол-миристилацетатом и иономицином секреция IL-10 и IL-4 клетками цельной крови больных с ЮИА была выше, чем в группе условно здоровых детей [20].

У обследованных нами больных с нРеА спонтанный уровень IL-4 в СКК не отличался от контрольных значений, а продукция IL-1rа и IL-10 была выше по сравнению с группой здоровых детей. В отечественной и зарубежной литературе отсутствуют данные об оценке секреции IL-1rа, IL-4 и IL-10 культурами клеток крови у детей с неуточненной реактивной артропатией. Имеются свидетельства, что у взрослых пациентов с реактивным артритом спонтанная секреция IL-4 клетками крови была снижена, а выработка IL-10 не отличалась от таковой у здоровых доноров [13]. В сыворотке крови взрослых больных с реактивным артритом в острый период заболевания был значительно снижен уровень IL-4, тогда как при хроническом течении этого заболевания выявлено умеренное увеличение концентрации этого цитокина [2]. Возможно, на более поздних стадиях заболевания подключаются компенсаторные механизмы, обуславливающие повышенный уровень противовоспалительных ЦК, что и было выявлено в нашем исследовании в отношении IL-1rа и IL-10. Более низкая стимулированная выработка IL-1rа в группе с нРеА по сравнению с контролем свидетельствует о том, что клетки-продуценты уже истощили свои резервы в условиях хронического воспалительного процесса.

Спонтанный и стимулированный уровень IL- 1rа и IL-10 у обследованных нами детей с СКВ не отличался от такового в группе УЗД. В одной из малочисленных публикаций, посвященных исследованию секреции ЦК in vitro, обнаружено увеличение спонтанного и стимулированного липополисахаридом синтеза IL-1ra клетками крови у взрослых пациентов с СКВ, по сравнению со здоровыми лицами [21].

При исследовании сыворотки крови, у детей с СКВ в активной стадии заболевания выявлены высокие уровни IL-10, по сравнению с пациентами с неактивной стадией заболевания и здоровыми детьми, уровень IL-4 не отличался от контрольных значений [14]. Другие авторы также обнаружили повышение сывороточной концентрации IL-10 при СКВ у детей [19] и взрослых [15, 22]. Также выявлена положительная корреляция сывороточного уровня IL-10 с активностью заболевания по шкале SLEDAI как у взрослых пациентов с СКВ [22], так и у детей [19].

Известно, что IL-10 увеличивает пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов и индуцирует продукцию аутоантител этими клетками при СКВ [17, 19]. Кроме того, отмечался позитивный эффект введения анти-IL-10 моноклональных антител пациентам с СКВ [16]. Однако в нашем исследовании никаких различий с контрольной группой по продукции этого ЦК не выявлено.

Спонтанная и стимулированная выработка IL-4 у обследованных нами детей с СКВ была ниже, чем в контрольной группе. Это согласуется с данными Guimaraes P.M. и соавт., которые выявили снижение уровня IL-4 в сыворотке крови у взрослых пациентов с СКВ [15]. Хотя есть ряд работ, в которых не найдено различий по сывороточной концентрации IL-4 между взрослыми больными с СКВ и здоровыми донорами [19, 22].

У обследованных нами детей с ХВГС спонтанная и стимулированная концентрация IL-4 и стимулированная концентрация IL-1rа были ниже, чем в группе здоровых детей. Гепатит С является вирусным заболеванием, однако в хронической стадии могут присоединяться аутоиммунные механизмы [6]. Снижение выработки противовоспалительных ЦК может косвенно свидетельствовать об активации аутоиммунитета. По данным литературы, у взрослых пациентов с ХВГС и ХВГВ, напротив, выявлено увеличение продукции IL-4 и IL-10 клетками крови в спонтанном и стимулированном ФГА вариантах [6]. В сыворотке крови и в супернатантах биоптатов печени у взрослых больных с ХГС также наблюдалось достоверное увеличение концентраций этих двух ЦК [8]. Однако эти пациенты могли находиться в более ранней стадии заболевания, еще до подключения аутоиммунных механизмов.

Заключение

Таким образом, в группах больных с СКВ, ЮИА и ХВГС спонтанная продукция противовоспалительных цитокинов IL-1rа, IL-4 и IL-10 либо не отличалась от контрольных значений, либо была снижена. Ведущим механизмом развития СКВ является аутоагрессия [19]. ЮИА имеет смешанную аутоиммунно-аутовоспалительную природу [1]. В хронической стадии вирусного гепатита С также могут развиваться аутоиммунные реакции [6]. Снижение синтеза противовоспалительных ЦК указывает на недостаточный контроль над воспалительным процессом при всех перечисленных заболеваниях, несмотря на их различную этиологию. Повышение спонтанной продукции IL-1rа и IL-10 у детей с нРеА может являться компенсаторным механизмом, сдерживающим развитие воспаления при этом заболевании [11].

Во всех исследованных группах стимулированная продукция IL-1rа, IL-4 и IL-10 либо не отличалась от группы здоровых детей, либо была ниже контрольных значений. Это свидетельствует об истощении функциональных резервов клеток, об их неспособности отвечать на дополнительный стимул.

Благодарности

Авторы искренне благодарят врачей ГАУЗ СО «ОДКБ» Козлову Е.С., Скоробогатову О.В., Салохину Е.Н. за подбор пациентов для исследования.

Об авторах

Ирина Михайловна Криволапова

ГАУЗ СО «Областная детская клиническая больница»; ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» Уральского отделения Российской академии наук

Email: krivolapovaim@mis66.ru

к.б.н., биолог клинико-диагностической лаборатории, младший научный сотрудник лаборатории иммунологии воспаления

Россия, 620149, Екатеринбург, ул. С. Дерябиной, 32; Екатеринбург

Ирина Александровна Пашнина

ГАУЗ СО «Областная детская клиническая больница»

Автор, ответственный за переписку.
Email: krivolapovaim@mis66.ru

д.б.н., заведующая клинико-диагностической лабораторией

Россия, 620149, Екатеринбург, ул. С. Дерябиной, 32

Список литературы

Дополнительные файлы