Оценка параметров митохондрий CD4+Т-лимфоцитов периферической крови методом проточной цитофлюориметрии

Полный текст

Работа выполнена в рамках государственного задания «Механизмы регуляции иммунной системы» (номер гос. регистрации АААА-А19-119112290007-7).

Введение

Митохондрии являются древнейшими органеллами клетки, участвующими в ее жизненно важных функциях, в том числе производстве энергии, обмене веществ, клеточном дыхании, продукции активных форм кислорода, пролиферации и гибели [2]. Необходимость удовлетворять метаболические и энергетические потребности клетки делает митохондрии динамичными: они способны к модификации формы и размера, в ходе чего могут изменяться масса и число органелл в клетке [2, 9]. Объем митохондрий может составлять до 20-25% от общего объема клетки. Важным показателем функционального состояния митохондрий является их трансмембранный потенциал. Он возникает при переносе протонов через комплексы электрон-транспортной цепи в межмембранное пространство и служит промежуточной формой хранения энергии, используемой аденозинтрифосфат (АТФ)-синтазой для образования АТФ [10]. Нарушение функции митохондрий ассоциировано с воспалением, нейродегенеративными расстройствами, злокачественными заболеваниями, диабетом, старением [1].

Для исследования заряда и массы митохондрий используются флюорохром-меченые зонды, способные спонтанно проникать в клетку [4, 10]. Так, для оценки мембранного потенциала митохондрий применяют катионные липофильные красители [4]. Катионы притягиваются к отрицательному потенциалу, формируемому вдоль внутренней мембраны митохондрий, и, таким образом, предпочтительно накапливаются в функционально активных митохондриях [6, 10]. Как следствие, более поляризованные митохондрии будут содержать больше красителя [12]. С другой стороны, для определения массы митохондрий важно использовать красители, чувствительность которых не зависит от поляризационного статуса органелл [4]. Флюоресценция клеток, окрашенных таким типом реагентов, прямо пропорциональна содержанию в них митохондрий (массе органелл), что обеспечивается за счет ковалентного связывания красителя с белками митохондрий [4, 11].

Одним из методов детекции сигналов от флюорохром-меченых зондов, окрасивших митохондрии, является проточная цитометрия. Этот высокочувствительный, относительно легкий и быстрый метод позволяет исследовать суспензии клеток в режиме «поштучного» анализа. Кроме того, сочетание флюорохром-меченых зондов с окрашиванием поверхностных маркеров дает возможность оценить статус митохондрий в различных популяциях клеток, например Т-лимфоцитах различной степени зрелости. Это особенно актуально при изучении метаболических параметров клеток иммунной системы при ВИЧ-инфекции, аутоиммунных, онкологических заболеваниях. Для демонстрации различий параметров митохондрий в качестве групп сравнения были взяты ВИЧ-инфицированные и неинфицированные субъекты.

Целью данной работы было исследование состояния митохондрий CD4⁺Т-лимфоцитов методом проточной цитометрии.

Материалы и методы

Объектом исследования были мононуклеарные клетки, полученные из периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов, принимающих противовирусные препараты (ВИЧ⁺; n = 21), и относительно здоровых добровольцев (ВИЧ^-; n = 23). Каждый участник подписал информированное согласие. План работы был одобрен этическим комитетом Пермского краевого центра по борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями (рег. № IRB00008964). Забор крови проводили в вакуумные пробирки, содержащие ЭДТА (Weihai Hongyu Medical Devices Co Ltd, Китай). Уровень вирусной нагрузки ВИЧ в плазме крови определяли набором Versant HIV- 1 RNA 3,0 assay b на анализаторе Versant 440 (Siemens, Германия). Мононуклеарные клетки выделяли центрифугированием двукратно разведенной крови (раствор фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS); Gibko, США) в градиенте плотности Диаколла (1,077 г/мл; Диаэм, Россия). Выделенные клетки помещали в термоинактивированную эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС; Biowest, Колумбия), содержащую 10% диметилсульфоксида (AppliChem, Германия), и подвергали контролируемому замораживанию в жидком азоте. Перед проведением исследования клетки размораживали.

Идентификацию жизнеспособных Т-лимфоцитов проводили на проточном цитофлюориметре Fortessa (Becton Dickinson, США) с применением моноклональных антител анти-CD3-AF700 (Becton Dickinson, США), анти-CD45RA-BV650 (Biolegend, США), анти-CD4-Qdot605 и витального красителя LIVE/DEAD^® Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit (Invitrogen, США). Субпопуляции CD45RA⁺ и CD45RA^- CD4⁺Т-лимфоцитов относили, соответственно, к наивным элементам и клеткам памяти.

С использованием митохондриально-селективных красителей MitoTracker™ Green FM и MitoTracker™ Orange CM-H2TMRos (Invitrogen, США) устанавливали массу и трансмембранный потенциал митохондрий соответственно. Краситель MT Green в виде нефлюоресцентного в водных растворах соединения спонтанно входит в клетку через поверхностную мембрану и избирательно накапливается в митохондриях. Оказавшись под внутренней мембраной митохондрий, реагент взаимодействует с остатками цистеина в составе митохондриальных белков, в результате чего переходит во флюоресцентную форму с максимумом эмиссии в зеленой области спектра [11]. Флюоресценция MT Green не зависит от трансмембранного потенциала митохондрий и прямо пропорциональна массе органелл [11]. Липофильный катионный краситель MT Оrange (нефлуоресцентная восстановленная форма тетраметилрозамина) также спонтанно проникает через билипидные мембраны, в том числе поверхностную мембрану клетки, наружную и внутреннюю мембрану митохондрий; накапливается в зоне с высокой концентрацией протонов (под внутренней мембраной митохондрий), где окисляется до флюоресцентной формы [4]. Этот эффект сопровождается изменением свечения клетки: при снижении концентрации протонов (понижение мембранного потенциала) уменьшается накопление красителя и, как следствие, снижается интенсивность свечения. Растворы реагентов готовили согласно инструкциям производителя. К мононуклеарным клеткам вносили MT Green и MT Orange в конечных концентрациях 25 нМ и 500 нМ соответственно. После инкубации проб (+37 °С, 30 мин) клетки отмывали центрифугированием в DPBS. Осадок ресуспендировали в DPBS и окрашивали клетки поверхностными флюорохром-мечеными антителами и витальным красителем. После инкубации (30 мин, комнатная температура, защищенное от света место) клетки отмывали центрифугированием в избыточном объеме раствора DPBS/2% ЭТС. Осадок ресуспендировали в растворе DPBS/2% ЭТС и проводили цитофлюориметрический анализ.

Математическую обработку данных выполняли в программе FlowJo VX (FlowJo LCC, США). Статистический анализ осуществляли с использованием непараметрических методов. В выборке рассчитывали медиану (Me) и интерквартильный размах (Q_0,25-Q_0,75). Достоверность различий определяли методом Манна–Уитни. Статистические расчеты и построение графиков выполняли с использованием программы Statistica 6.

Результаты и обсуждение

ВИЧ-инфицированные пациенты более 3 лет получали антиретровирусную терапию (АРТ), эффективность которой подтверждалась подавлением репликации вируса: вирусная нагрузка ВИЧ в крови < 50 копий/мл (предел чувствительности тест-системы). Группы ВИЧ⁺ и ВИЧ^- были сопоставимы по возрасту и полу (p > 0,05). Численность CD4⁺Т-лимфоцитов у ВИЧ⁺ была существенно ниже, чем у здоровых лиц: 534 (438-656) мкл^-1 и 885 (772-1262) мкл^-1 (p < 0,001).

При исследовании трансмембранного потенциала и массы митохондрий CD4⁺Т-лимфоцитов было установлено следующее. Медиана интенсивности свечения потенциал-чувствительного красителя MT Оrange у ВИЧ⁺ была сопоставима с таковой в группе ВИЧ^- (p > 0,05; рис. 1). Аналогичные данные были получены при оценке показателей в наивных элементах и клетках памяти (p > 0,05). При этом в последних заряд мембраны митохондрий был выше, что оказалось справедливым для обеих исследованных групп (p < 0,05).

 

Рисунок 1. Оценка трансмембранного потенциала митохондрий CD4⁺Т-лимфоцитов с использованием красителя MitoTracker Orange. Примечание. По оси абсцисс указаны группы сравнения: ВИЧ-инфицированные (ВИЧ⁺) и неинфицированные (ВИЧ^-) субъекты. По оси ординат показана медиана яркости флюоресценции (MFI: Median Fluorescence Intensity) MitoTracker Orange в клетках с функционально активными митохондриями. Представлены медианы (горизонтальные линии внутри прямоугольников), интерквартильные интервалы (прямоугольники) и 10-90%-ные размахи (вертикальные отрезки). Статистические расчеты выполнены по методу Манна–Уитни. / Figure 1. Assessment of mitochondrial transmembrane potential in CD4⁺T cells using the MitoTracker Orange dye. Note. The x-axis shows the comparison groups: HIV-infected (HIV⁺) and uninfected (HIV^-) subjects. The y-axis shows the median fluorescence intensity (MFI: Median Fluorescence Intensity) of MitoTracker Orange in cells with functionally active mitochondria. Medians (horizontal lines within boxes), interquartile ranges (boxes), and 10-90% ranges (vertical bars) are shown. Statistical calculations were made using the Mann–Whitney method.

 

Цитофлюориметрический анализ показал, что CD4⁺Т-лимфоциты ВИЧ-инфицированных и неинфицированных субъектов существенно отличались способностью накапливать краситель MT Green в митохондриях. Средняя интенсивность свечения клеток в группе ВИЧ⁺ была выше, чем у ВИЧ^- (p < 0,05; рис. 2), что свидетельствовало о более высокой массе митохондрий в CD4⁺Т-лимфоцитах ВИЧ-зараженных лиц. При этом, хотя медиана яркости свечения MT Green в наивных CD4⁺Т-клетках у ВИЧ⁺ была выше соответствующей величины, установленной у ВИЧ^-, статистически значимых различий между группами выявлено не было (p > 0,05). В отличие от наивных элементов CD4⁺Т-лимфоциты памяти накапливали больше MT Green в митохондриях, что проявлялось увеличением флюоресценции клеток. Этот эффект был отмечен как у ВИЧ⁺ (p < 0,01), так и в группе ВИЧ^- (p < 0,05). Вместе с тем сниженная относительно ВИЧ⁺ интенсивность свечения красителя в CD4⁺Т-лимфоцитах памяти здоровых лиц свидетельствовала о более высокой массе митохондрий в данной субпопуляции клеток у ВИЧ-позитивных субъектов (p < 0,01).

 

Рисунок 2. Исследование массы митохондрий в CD4⁺Т-лимфоцитах с использованием красителя MitoTracker Green. Примечание. По оси абсцисс указаны группы сравнения: ВИЧ-инфицированные (ВИЧ⁺) и неинфицированные (ВИЧ^-) субъекты. По оси ординат показана медиана яркости флюоресценции (MFI: Median Fluorescence Intensity) MitoTracker Green в клетках, содержащих краситель в матриксе митохондрий. Представлены медианы (горизонтальные линии внутри прямоугольников), интерквартильные интервалы (прямоугольники) и 10-90% размахи (вертикальные отрезки). * – p < 0,05; ** – p < 0,01 (U-критерий Манна–Уитни). / Figure 2. Study of mitochondrial mass in CD4⁺T lymphocytes using MitoTracker Green dye. Note. The x-axis shows the comparison groups: HIV-infected (HIV⁺) and uninfected (HIV^-) subjects. The y-axis shows the median fluorescence intensity (MFI: Median Fluorescence Intensity) of MitoTracker Green in cells containing the dye in the mitochondrial matrix. Medians (horizontal lines within boxes), interquartile ranges (boxes), and 10-90% ranges (vertical bars) are shown. *, p < 0.05; **, p < 0.01 (Mann–Whitney U test).

 

Таким образом, в настоящей работе нами показана возможность использования митохондриально-селективных красителей MitoTracker Green и MitoTracker Orange для относительно быстрой оценки состояния митохондрий методом проточной цитометрии. Нами установлено, что у получающих АРТ ВИЧ-инфицированных пациентов по сравнению со здоровыми донорами увеличена масса митохондрий CD4⁺Т-лимфоцитов, что, однако, не сопровождается ростом мембранного потенциала органелл. Ранее рядом авторов также не было выявлено отличий между показателями мембранного потенциала митохондрий CD4⁺Т-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных субъектов, находящихся на АРТ, и здоровых лиц [8, 14]. При этом если одни исследователи отмечали отсутствие различий в массе митохондрий CD4⁺Т-клеток [8], то другие, напротив, указывали на более высокую массу органелл у ВИЧ-позитивных больных, получающих АРТ [14].

Необходимо отметить, что оба использованных нами красителя обладают не только ранее описанными преимуществами, но и недостатками. Так, MitoTracker Green связывается с белками, локализованными на внутренней мембране органелл и, по-видимому, интенсивность свечения клетки после окрашивания данным реагентом будет в большей мере коррелировать с площадью поверхности внутренней мембраны, чем с общей массой митохондрий [4, 11]. Это может быть критически важным, поскольку не только разные клетки отличаются составом мембранных белков и их расположением, но и одинаковые клетки могут иметь различное метаболическое состояние [13]. Более того, было показано, что трансмембранные АТФ-связывающие кассетные транспортеры (ATP-binding cassette transporters, ABC), выводящие из клетки различные субстраты, обладают способностью выкачивать краситель MitoTracker Green из CD4⁺Т-лимфоцитов [5].

Исходя из вышеизложенного, для более корректной оценки состояния митохондрий методом проточной цитометрии (в дополнение к определению массы и заряда органелл) необходимо также исследовать их функциональные параметры. К таковым можно, например, отнести уровень продукции митохондриями активных форм кислорода; выход в цитоплазму цитохрома при нарушении проницаемости мембраны органелл; определение митохондриального транскрипционного фактора А (mitochondrial transcription factor A, TFAM) – белка, связанного с транскрипцией и репликацией митохондриальной ДНК [3, 7, 8]. Для цитофлюориметрического исследования этих параметров существуют различные флюорохром-меченые зонды.

Заключение

Таким образом, нами показано, что по сравнению со здоровыми донорами у ВИЧ-инфицированных субъектов повышена масса митохондрий в общем пуле CD4⁺Т-лимфоцитов и в субпопуляции клеток памяти. Вместе с тем увеличение массы органелл не сопровождается ростом заряда мембраны митохондрий. В целом, цитофлюориметрическое определение массы и мембранного потенциала митохондрий с использованием митохондриально-селективных красителей MitoTracker Green и MitoTracker Orange является относительно легким, быстрым и информативным способом предварительной оценки состояния органелл в клетках.

Об авторах

Лариса Борисовна Королевская

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Автор, ответственный за переписку.
Email: bioqueen@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9840-7578

к.м.н., научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии

Россия, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Евгения Владимировна Сайдакова

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Email: radimira@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-4342-5362
Scopus Author ID: 54882274000
ResearcherId: C-8333-2015

д.б.н., заведующая лабораторией молекулярной иммунологии

Россия, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Константин Владимирович Шмагель

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Email: shmagel@iegm.ru
ORCID iD: 0000-0001-6355-6178

д.м.н., заведующий лабораторией экологической иммунологии

Россия, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Список литературы

Дополнительные файлы