Plasma extracellular DNA and neutrophilic leukocyte activity in patients with rheumatoid arthritis

Elena D. Gavrilova; Гаврилова Елена Давидовна; Elena N. Demchenko; Демченко Елена Николаевна; Elena V. Goiman; Гойман Елена Владимировна; Oksana A. Chumasova; Чумасова Оксана Александровна; Nikolay N. Volskiy; Вольский Николай Николаевич; Alexey E. Sizikov; Сизиков Алексей Эдуардович; Vladimir A. Kozlov; Козлов Владимир Александрович

doi:10.46235/1028-7221-1110-PED

Внеклеточная ДНК в плазме крови и активность нейтрофильных лейкоцитов у пациентов с ревматоидным артритом

Авторы: Гаврилова Е.Д.¹, Демченко Е.Н.¹, Гойман Е.В.¹, Чумасова О.А.¹, Вольский Н.Н.¹, Сизиков А.Э.¹, Козлов В.А.¹
Учреждения:
1. ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии»
Выпуск: Том 25, № 2 (2022)
Страницы: 147-154
Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Дата подачи: 15.05.2022
Дата принятия к публикации: 28.05.2022
Дата публикации: 01.09.2022
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/1110
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-1110-PED
ID: 1110

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Нейтрофильные лейкоциты играют ключевую роль в поражении суставов при развитии ревматоидного артрита (РА). Процесс специфической гибели этих клеток (нетоз) может быть важным источником происхождения обнаруживаемого в крови пациентов с РА повышенного уровня внДНК. Большой интерес представляет изучение предполагаемой зависимости между содержанием в крови внДНК, способной играть роль аутоантигена и таким образом участвовать в инициации аутоиммунных реакций и показателями активации нейтрофилов при этом иммунопатологическом состоянии. Целью исследования стало определение уровней внДНК в плазме крови пациентов с РА в зависимости от клинических показателей течения заболевания и выявление возможной связи данного показателя с активацией нейтрофильных лейкоцитов. В исследование были включены 63 пациента с РА, находившиеся на стационарном лечении в ревматологическом отделении клиники иммунопатологии НИИФКИ (г. Новосибирск) и 28 условно здоровых доноров. Определение уровня внДНК проводили с помощью флюоресцентного красителя PicoGreen. Нейтрофилы из периферической крови доноров и пациентов с ревматоидным артритом выделяли в двойном градиенте плотности фиколл-урографин. Нейтрофильные лейкоциты составляли более 98% во фракции выделенных клеток, а их жизнеспособность составляла 99%. Часть свежевыделенных нейтрофилов стимулировали добавлением форболмиристат-ацетата (PMA). Концентрацию миелопероксидазы в плазме крови доноров и пациентов с РА определяли с помощью набора Human MPO ELISA kit. Показано, что возрастание концентрации внеклеточной ДНК в плазме крови пациентов с РА происходит параллельно увеличению степени активности заболевания, и данный параметр может служить относительно независимым показателем интенсивности патологического процесса. Выявлены статистически достоверные корреляции уровня внДНК с основными показателями, позволяющими оценивать активность заболевания в клинике: DAS-28 и уровнем С-реактивного белка в сыворотке (p < 0,05). У пациентов с ревматоидным артритом на фоне лечения наблюдается снижение концентрации внДНК в плазме, что может быть связано с положительным прогнозом: снижением клинических проявлений заболевания, а значит, и правильно подобранной терапией. Установлена корреляция между уровнем внДНК и концентрацией миелопероксидазы в крови пациентов с РА. Полученные при исследовании данные говорят о возможной связи повышенной концентрации внеклеточной ДНК с активацией нейтрофильных лейкоцитов при ревматоидном артрите и с усилением нетоза в пораженных суставах.

Ключевые слова

внеклеточная ДНК, нейтрофильные лейкоциты, нетоз, миелопероксидаза

Полный текст

Исследование выполнено за счет средств федерального бюджета для выполнения государственного задания на научно-исследовательскую работу «Изучение иммунопатогенеза фенотипов социально значимых заболеваний человека и полиморбидности как основа для разработки новых методов персонифицированной диагностики и лечения» (РК № 122012000366-9).

Введение

В последние десятилетия было установлено, что содержание внеклеточной ДНК (внДНК) в циркулирующей крови человека и животных закономерно изменяется при различных патофизиологических процессах и может служить показателем их динамики. Существенные изменения этого параметра обнаружены у пациентов с различными видами опухолей, при воспалительных реакциях, иммунопатологических состояниях и других заболеваниях (в качестве обзора см. работы [1, 7]). Поскольку предполагается, что внДНК способна играть роль аутоантигена и участвовать в инициации аутоиммунных реакций, внимание исследователей было привлечено к изменениям ее концентрации в крови при болезнях, обусловленных нарушениями деятельности иммунной системы и, в частности, при ревматоидном артрите (РА). Было показано, что уровень внДНК в плазме крови при РА существенно повышен и в некоторых случаях может быть связан с особенностями патологического процесса у индивидуальных больных [7, 8, 11].

Нейтрофильные лейкоциты играют ключевую роль в поражении суставов при развитии РА и нетоз этих клеток (то есть выход фрагментов ядерного материала в комплексе с разнообразными гидролитическими ферментами за пределы цитоплазматической мембраны и формирование специфической внеклеточно расположенной «сети») может быть важным источником происхождения внДНК, обнаруживаемой в крови пациентов с РА.

В связи с этим целью настоящей работы стало изучение зависимости уровня внДНК в плазме крови пациентов с РА от клинических показателей течения болезни и выявление возможной связи между активацией нейтрофильных лейкоцитов и уровнем внДНК.

Материалы и методы

Характеристика пациентов

В данную работу были включены 63 пациента с РА, находившиеся на стационарном лечении в ревматологическом отделении клиники иммунопатологии НИИФКИ (г. Новосибирск). Право на участие в исследовании подтверждалось письменным информированным согласием. Протокол обследования был одобрен локальным этическим комитетом.

Исследованная группа состояла из 54 женщин (85%) и 9 мужчин (15%) в возрасте от 22 до 83 лет (медиана – 55 лет). По степени активности заболевания исследуемые были разделены на три группы: 1 – с низкой активностью (DAS-28 < 3,2), 2 – с умеренной (DAS-28 – от 3,2 до 5,1) и 3 – с высокой активностью (DAS-28 > 5,1). В клиники иммунопатологии НИИФКИ у всех исследуемых было определено наличие ревматоидного фактора, антител к циклическому цитруллинсодержащему пептиду и уровень С-реактивного белка в сыворотке крови, что учитывалось при постановке диагноза РА и использовано в данном исследовании.

В исследование включены 28 образцов от условно здоровых доноров, набранных на Пункте забора донорской крови ГКБ № 1 г. Новосибирска.

Методы исследования

Выделение внеклеточной ДНК

Забор периферической крови для проведения анализа осуществлялся с помощью венозной пукнции в вакуумную пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА).

Плазму отделяли от форменных элементов центрифугированием при 400g в течение 20 мин [12]. Выделение внеклеточной ДНК из плазмы проводили на колонках компании «БиоСилика» (г. Новосибирск) согласно инструкции по применению «Набора для выделения ДНК из плазмы крови». Определение ДНК проводили с помощью флюоресцентного красителя PicoGreen (Invitrogen). Концентрация ДНК пересчитывалась по калибровочной кривой, построенной для известных концентраций стандартной двуцепочечной λ ДНК.

Уровень метилирования ДНК был определен с помощью набора реагентов Methyl Flash Methylated DNA Quantification Kit (Colorimetric) (Epigentek, США) согласно протоколу производителя. В основе метода лежит колориметрическое иммуноферментное определение процентного содержания 5-метилцитозина в образце ДНК. Оптическая плотность образцов измерялась на спектрофотометре Model 680 Microplate Reader (Bio-Rad, США) при длине волны 450 нм.

Выделение нейтрофилов

Периферическую кровь у доноров и пациентов с ревматоидным артритом забирали в утренние часы натощак в пропиленовые пробирки с гепарином (20 ME/мл крови). Нейтрофилы выделяли с помощью центрифугирования в двойном градиенте плотности фиколл-урографин (ρ = 1,077 г/см³ и ρ = 1,119 г/см³) при 400 g 25 мин. Полученное кольцо нейтрофилов переносили в пробирки и трижды отмывали в 5 мл PBS, центрифугируя при 200 g 10 минут, а затем ресуспендировали в культуральной среде, включающей RPMI-1640 без фенолового красного с добавлением 1% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки. Нейтрофильные лейкоциты составляли более 98% во фракции выделенных клеток, а их жизнеспособность составляла 99%, что определялось тестом с трипановым синим.

Определение спонтанного и стимулированного нетоза нейтрофилов in vitro

Свежевыделенные нейтрофилы переносили в черный планшет в концентрации 2 х 10⁵ клеток на лунку и часть из них стимулировали добавлением форболмиристат-ацетата (Sigma Aldrich, Франция) до концентрации 50 nM, с последующим культивированием при 37 °С в атмосфере 5% CO₂в течение 3 часов. Затем в лунки вносили 5 µM Sytox Green (Invitrogen, США). Уровень флюоресценции регистрировали на ридере TristarTM LB941 BERTHOLD (Германия): длина волны возбуждения – 485 нм и длина волны излучения – 527 нм [3].

Определение миелопероксидазы

Концентрацию миелопероксидазы в плазме крови больных определяли иммуноферментным методом с помощью набора Human MPO ELISA kit (HycultBiotech, Нидерланды).

Ревматоидный фактор (суммарное определение субклассов IgA-, IgM- и IgG-аутоантител) определяли в лаборатории клинической иммунологии клиники иммунопатологии НИИФКИ на анализаторе специфических белков Immage 800 (Beckman Coulter).

Статистическая обработка

Результаты в таблице и на рисунке приведены в виде средних величин. Достоверность выявленных различий и величину связей между измеренными параметрами оценивали методами непараметрической статистики с использованием U-критерия Манна–Уитни, Т-критерия Вилкоксона и коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

Результаты и обсуждение

Данные, полученные при проведении данного исследования, убедительно свидетельствуют о значительном увеличении содержания свободной внеклеточной ДНК в плазме крови пациентов с РА и о тесной связи этого параметра с активностью заболевания.

На рисунке 1 видно, что среднее содержание внДНК у пациентов, поступивших в клинику с диагнозом РА и рассматриваемых как единая группа, в несколько раз превосходит величину этого показателя в группе здоровых доноров (рис. 1А). Также показано, что такое увеличение количества внДНК в плазме крови прямо связано со степенью активности патологического процесса у конкретных пациентов (рис. 1Б).

Рисунок 1. Концентрация внДНК в плазме крови условно здоровых доноров и пациентов с ревматоидным артритом. Примечание. По оси ординат – уровень внеклеточной ДНК, нг/мл. По оси абцисс – группы: А: 1 – условно здоровые доноры (n = 18); 2 – группа пациентов с РА (n = 58). Б – уровни внДНК у пациентов с РА в зависимости от степени активности патологического процесса: 1 – группа пациентов с низкой активностью (n = 9); 2 – с умеренной активностью (n = 26); 3 – с высокой активностью заболевания (n = 23). *** – достоверное отличие от доноров (p < 0,001). / Figure 1. Concentration of cfDNA in the blood plasma of conditionally healthy donors and patients with rheumatoid arthritis. Note. The y-axis shows the level of extracellular DNA, ng/mL. On the abscissa axis – groups: (A) 1, conditionally healthy donors (n = 18); 2, group of patients with RA (n = 58). (B) levels of cfDNA in patients with RA depending on the degree of activity of the pathological process: 1, group of patients with low activity (n = 9); 2, with moderate activity (n = 26); 3, with high disease activity (n = 23). ***, significant difference from donors (p < 0.001).

При этом в группе с наименьшей активностью заболевания (группа 1; среднее значение DAS-28 – 2,80) уровень внДНК был практически вдвое ниже, чем ее уровни в группах 2 (DAS-28 – 4,11) и 3 (DAS-28 – 5,85). О значимой положительной связи концентрации внДНК в плазме крови пациентов с РА со степенью активности патологического процесса, наблюдаемого у них в период исследования, говорят и статистически достоверные корреляции уровня внДНК с основными показателями, позволяющими оценивать активность заболевания в клинике: DAS-28 (ρ = 0,319; p < 0,05) и уровнем С-реактивного белка в сыворотке (ρ = 0,270; p < 0,05). Полученные результаты хорошо согласуются с данными, опубликованными другими авторами [7, 8, 11], о повышении уровня внДНК при РА и о связи этого показателя с клиническим течением болезни.

У части исследованных пациентов (24 человека) уровень внДНК был определен дважды: при поступлении в клинику и после курса назначенного лечения (как правило, введение ритуксимаба или тоцилизумаба, стероидных гормонов и вазоактивная терапия). Полученные при этом данные также свидетельствуют о существовании закономерной связи исследуемого параметра с клинической картиной заболевания. Исходно повышенный уровень внДНК в этой группе пациентов существенно снизился с 52,92 нг/мл до 36,56 нг/мл (p < 0,05) после курса специфической терапии. При этом наблюдалось и параллельное уменьшение степени активности патологического процесса, оцениваемой по величине DAS-28: после лечения этот показатель снизился с 4,44 до 4,01 (p < 0,01).

Немаловажное значение в нарастании количества внДНК при развитии заболевания может иметь обнаруженное у пациентов с РА увеличение доли ДНК митохондриального происхождения в общем пуле внДНК [11]. Будучи сходной с бактериальной ДНК, в частности по значительно более низкому, чем в ядерной ДНК уровню метилирования нуклеотидов [7, 10], эта фракция нуклеиновых кислот способна – через рецептор TLR9 – стимулировать интенсивность воспалительных реакций [13, 14]. Следовало ожидать, что развитие РА, будет сопровождаться снижением степени метилирования общего пула внДНК. Действительно, метилирование внДНК в исследованной группе пациентов с РА (17,5%) оказалось несколько ниже, чем у здоровых доноров (20,8%). После проведенного курса соответствующей терапии отмечена тенденция к повышению процентного содержания 5-метилцитозина в образцах ДНК у пациентов (21,7%). Увеличение выборки исследованных пациентов, возможно, позволит достоверно подтвердить наличие нарушения эпигенетических механизмов, наблюдаемых при ауотоиммунных заболеваниях, в частности при РА.

Существенным результатом проведенного исследования можно считать выявление связи между уровнем внДНК и концентрацией миелопероксидазы в крови пациентов с РА. У исследованных пациентов с РА среднее содержание этого характерного для нейтрофильных лейкоцитов фермента составляло 22,8 нг/мл, что значимо превышало величину данного показателя у здоровых доноров – 9,7 нг/мл (p < 0,05). При этом возрастание концентрации миелопероксидазы в крови пациентов с РА обнаруживалось параллельно увеличению у них уровня внДНК, и коэффициент ранговой корреляции (ρ) между этими параметрами был равен 0,412 (p < 0,05). Поскольку наличие миелопероксидазы – специфический признак нейтрофилов, ее появление в крови расценивается обычно как показатель активации и нетоза с выходом цитоплазматических белков во внеклеточную среду [5]. Таким образом, исходя из полученных нами данных, можно предполагать, что увеличение концентрации внДНК у пациентов с РА в значительной степени обусловлено нетозом нейтрофилов и появлением их ДНК во внеклеточном пространстве, а следовательно, изменения этого параметра могут рассматриваться и в качестве косвенного признака вовлеченности нейтрофильных лейкоцитов в иммунопатологический процесс. В пользу такого предположения свидетельствуют и данные Birkelund и соавт. [4], убедительно обосновывающие нейтрофильное происхождение внДНК в синовиальной жидкости пораженных суставов у пациентов с РА.

Одной из задач данной работы было определение функционального состояния нейтрофильных лейкоцитов из крови больных РА и их готовность к реакции нетоза с появлением нитей ДНК во внеклеточном пространстве, так называемой, нейтрофильной ДНК (внДНКн). Результаты этого исследования приведены в таблице 1.

Таблица 1. Флуоресцентная интенсивность нетоза пациентов с ревматоидным артритом (РА) и условно здоровых доноров / Table 1. Fluorescent intensity of netosis in patients with rheumatoid arthritis (RA) and healthy donors

Параметры Parameters	Здоровые доноры Healthy donors	Пациенты с РА Patients with RA	p-значения p-value
Нетоз спонтанный Spontaneous netosis	1344549	1388928	p < 0,05
Нетоз при стимуляции Netosis on stimulation	1825981	2633243	p < 0,001
Индекс стимуляции Stimulation Index	1,30	2,06	p < 0,001

Примечание. Интенсивность нетоза представлена в условных единицах (интенсивность флуоресценции красителя) и отражает относительное количество ДНК нейтрофильных лейкоцитов, перешедшее в раствор после трехчасовой инкубации in vitro.

Note. The intensity of netosis is presented in conventional units (dye fluorescence intensity) and reflect the relative amount of neutrophils DNA that passed into solution after a three-hour incubation in vitro.

Видно, что интенсивность спонтанного (без каких-либо внешних воздействий) нетоза нейтрофилов, выделенных из крови пациентов с РА, лишь не намного (но статистически достоверно) превышает аналогичный показатель у здоровых лиц. В то же время на стимуляцию клеток PMA нейтрофилы пациентов с РА отвечают значительно более выраженной реакцией, нежели лейкоциты доноров, что отчетливо видно при сравнении индексов стимуляции в этих группах испытуемых. Можно считать, что нейтрофильные лейкоциты пациентов с РА находятся в примированном состоянии, потенцирующем ответ этих клеток на сигналы, вызывающие запуск реакции нетоза. Такое утверждение об особом активированном состоянии нейтрофилов при РА не вызывает удивления, поскольку издавна полиморфноядерные нейтрофильные лейкоциты считаются клетками, играющими ключевые роли в развитии воспалительного поражения суставов при этом заболевании. В литературе достаточно работ, в которых описана активация лейкоцитов у пациентов с РА, приводящая к усилению их нетоза в условиях in vitro [6, 9].

Следует обратить внимание на то обстоятельство, что у исследованных пациентов не было обнаружено какой-либо значимой корреляции между показателями спонтанного и стимулированного нетоза in vitro, с одной стороны, и концентрацией внДНК в крови, с другой. На первый взгляд, этот результат ставит под сомнение ранее высказанное утверждение о существенной роли нетоза нейтрофилов в резком увеличении уровня внДНК у таких пациентов. Видимую противоречивость полученных результатов нетрудно объяснить, если принять во внимание тот факт, что выявленная примированность нейтрофилов из периферической крови представляет собой системный показатель и отражает общее состояние нейтрофильных лейкоцитов при данной патологии, в то время как на уровень внДНК может влиять лишь интенсивность нетоза в конкретных участках воспаления пораженных суставов. В тех же случаях, когда уровень внДНК и интенсивность нетоза определялись непосредственно на месте (в синовиальной жидкости воспаленных суставов) тесная корреляция между этими параметрами выявлялась вполне отчетливо [4].

В относительно недавней работе Aleyd и соавт. [2] было показано, что субкласс IgA-аутоантител, входящий в состав ревматоидного фактора (РФ), способен фиксироваться на поверхности нейтрофильных лейкоцитов, вызывая их нетоз и, соответственно, выход ДНК за пределы клеточной мембраны. Исходя из этого, можно было бы ожидать, что у больных РА должна выявляться некоторая связь между содержанием РФ в крови и показателями активации нейтрофилов. В проведенном нами исследовании корреляция между общим ревматоидным фактором в сыворотке крови больных и спонтанным нетозом их нейтрофилов in vitro оказалась незначительна (ρ = 0,217; p > 0,05). При дополнительном сравнении интенсивности нетоза in vitro в группах пациентов с низким (< 20 ME) и высоким (> 20 ME) содержанием РФ в крови обнаружено, что при высоком уровне РФ нетоз оказался более интенсивным нежели в оппозитной группе больных (1494256 vs 1206158), но это различие не достигало уровня статистической достоверности (p = 0,09). Однако полученные результаты нельзя считать противоречащим факту, установленному в работе Aleyd и соавт. Расхождения легко объяснимы тем, что функционально активный субкласс IgA-аутоантител, составляет лишь часть в общей величине РФ, и, вероятно, вследствие этого, в нашем исследовании связь между общим уровнем РФ, суммарным определением субклассов IgA-, IgM- и IgG-аутоантител, и нетозом нейтрофилов оказывается размытой.

Заключение

Согласно полученным в настоящем исследовании данным, уровень внДНК в плазме крови больных РА способен служить относительно независимым показателем степени активности патологического процесса при этом заболевании. В связи с этим можно говорить о перспективности анализа данного параметра в качестве дополнительного критерия оценки при комплексной диагностики патогенеза РА и эффективности подбора проводимой терапии. В то же время зависимость внДНК от степени активации и интенсивности нетоза нейтрофильных лейкоцитов еще не до конца выяснена и требует дальнейшего изучения.