Сравнительная характеристика содержания цитокинов в супернатантах нейтрофилов после инкубации их с суточными культурами S. aureus, имеющих и не имеющих ген spA

Полный текст

Введение

Ранее нашими исследованиями было показано, что грамположительные и грамотрицательные бактерии способны секретировать во внешнюю среду цитокиноподобные вещества [3]. При этом наибольшей, как по спектру, так и по уровню цитокиноподобной активности обладают стафилококки [3, 4, 5, 6, 8, 9, 10], среди которых отдельное внимание заслуживает золотистый стафилококк, как один из основных возбудителей внебольничных и внутрибольничных инфекций по всему миру. Обладая широким репертуаром факторов патогенности, обусловленного особенностями структуры генома, золотистый стафилококк инициирует в клетках макроорганизма синтез и секрецию молекул и медиаторов, обеспечивающих реакцию воспаления и, соотвественно, провосполительных цитокинов [13].

Сравнительно недавно, было установлено непосредственное взаимодействие стафилококкового фактора вирулентности (белок А) с рецептором фактора некроза опухоли 1 в эпителии дыхательных путей и зафиксировано воспроизведение эффектов фактора некроза опухоли альфа [12]. Что согласуется с нашими недавними исследованиями, где было показано, что у некоторых стафилококков это связано с наличием у них белка А [6, 8, 11]. В то же время было показано, что стафилококки, не имеющие белка А, также обладают выраженной способностью секретировать цитокиноподобные вещества [6, 8].

Ранее нами было показано, что стафилококки влияют на спонтанную продукцию цитокинов нейтрофилами [1, 2]. Однако, влияние на спонтанную продукцию цитокинов нейтрофилами стафилококков, имеющих белок А и не имеющих белок А, но при этом обладающих высокой цитокиноподобной активностью, ранее не изучалось.

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния клинических и музейных штаммов S. aureus на продукцию цитокинов нейтрофилами при использовании тест-систем для мультиплексного анализа, с учетом различий генетических детерминант по гену spА.

Материалы и методы

Исследования проведены на базе Института иммунологии и физиологии УрО РАН (г. Екатеринбург), Оренбургского федерального научного центра УрО РАН в филиале Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (г. Оренбург).

В экспериментах использовали 20 клинических изолятов S. aureus, из них 10 – имеющих ген spА и 10 – не имеющих ген spА, но при этом были отобраны штаммы, обладающие очень высокой способностью секретировать цитокиноподобные вещества (ЦПВ), как по уровню, так и по спектру цитокинов. Штаммы стафилококков были получены от разных больных и с различных эпитопов их обитания. Часть изолятов были выделены из ран у больных с синдромом диабетической стопы, другие из влагалища у женщин с миомой матки, из пустул у новорожденных с пиодермией. Изучали суточные культуры бактерии, выращенных на мясопептонном бульоне (МПБ), после чего культуры центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут, потом концентрацию бактерий доводили до 10⁸. Штаммы S. aureus разделяли на две группы в зависимости от spA-статуса, установленного с помощью банка данных по типированию генов spА (http://spa.ridom.de/).

Нейтрофилы доноров, выделенные на двойном градиенте фиколл-верографина по стандартной методике, доводили после промывки до концентрации 5 × 10⁶ клеток/мл, и инкубировали в среде RPMI-1640 в течение одного часа при 37 °С в термостате с бактериями (опыт) или без них (контроль). Бактерии брали в соотношении 1:20 к нейтрофилам (в концентрации 10⁸ бактерий /мл).

Влияние стафилококков на секрецию цитокинов нейтрофилами определяли на приборе Magpix-100 (США), с использованием иммунофлюоресцентных мультиплексных наборов компании БиоРад (США) для детекции 17 цитокинов (G-CSF, GM-CSF, IFNγ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, TNFα, MCP-1, MIP-1β) после 1 часа инкубации с нейтрофилами. Контролем выступил супернатант неактивированных нейтрофилов. Полученные результаты округляли до 0,1- 0,9 пкг/мл.

Анализ и систематизация экспериментальных данных, а также визуализация, полученных результатов осуществлялись в электронных таблицах Microsoft Office Excel 2013. Данные по концентрациям определяемых веществ выражали при помощи среднеарифметического значения группы и его стандартного отклонения. Результаты полученных данных описывались при помощи среднеарифметического значения (M) и стандартной ошибки среднего (m). Достоверность отличий определяли с помощью U-критерия Манна–Уитни (различия считали достоверными при р < 0,05) [7]. для независимых совокупностей с помощью программы IBM SPSS Statistics версия 23.0.

Результаты и обсуждение

Полученные данные, суммированные в таблице 1, свидетельствуют о том, что клинические изоляты S. aureus при инкубации с нейтрофилами изменяют способность этими клетками секретировать цитокины. При этом такая способность была различна у S. aureus, в зависимости spA-статуса. Так, S. aureus, у которых присутствует ген белка А, значительно стимулировали секрецию нейтрофилами IL-1β, TNFα (провоспалительные цитокины), но при этом снижали секрецию IL- 8, MIP-1β (хемокины). В то время как S. aureus, у которых нет белка А, в основном вызывали стимуляцию секреции ростовых факторов и провоспалительных цитокинов, таких как G-CSF, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-1β, IL-2, TNFα, При этом степень активации этих цитокинов, за исключением IL-1β , была выше не только по отношению к контролю, но и по отношению к стафилококкам, имеющих ген к белку А. Кроме того, оба варианта стафилококков снижали секрецию нейтрофилами IL-6, но имеющие белок А бактерии снижали IL-6 наиболее интенсивно по сравнению со стафилококками, не имеющими этого белка.

 

ТАБЛИЦА 1. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОДЕРЖАНИЯ ЦИТОКИНОВ В СУПЕРНАТАНТЕ НЕЙТРОФИЛОВ ПОСЛЕ 1-ЧАСОВОЙ ИНКУБАЦИИ ИХ С S. AUREUS, С НАЛИЧИЕМ ИЛИ ОТСУТСТВИЕМ ГЕНА spА

TABLE 1. COMPARATIVE CHARACTERISTICS OF THE CYTOKINE CONTENT IN THE NEUTROPHIL SUPERNATANT AFTER 1-HOUR INCUBATION WITH S. AUREUS, WITH THE PRESENCE OR ABSENCE OF THE spА GENE

Цитокины Cytokines	Контроль (супернатант неактивированных нейтрофилов) пкг/мл Control (supernatant of inactive neutrophils) pkg/mL (n = 10), M±m	Супернатант нейтрофилов после инкубации с S. aureus (Ген spА+) пкг/мл Neutrophil supernatant after incubation with S. aureus (spА+ gene) pkg/mL (n = 10), M±m	Супернатант нейтрофилов после инкубации с S. aureus (Ген spА-) пкг/мл Neutrophil supernatant after incubation with S. aureus (spА- gene) pkg/mL (n = 10), M±m
G-CSF	19,3±1,6	21,00±0,48	60,0±9,8**,***
GM-CSF	250,3±5,6	254,00±0,72	251,50±1,81
IL-10	35,4±3,4	40,00±0,24	52,00±3,13**,***
IL-12p70	23,5±1,6	22,50±0,36	34,00±2,11**,***
IFNγ	13,5±1,5	13,50±0,36	14,50±0,36
IL-13	11,4±1,3	11,00±0,36	12,00±0,36
IL-17A	62,5±5,6	60,00±0,24	174,0±24,3**,***
IL-1β	42,3±3,4	657,0±118,0*	698,0±87,5***
IL-2	38,4±4,5	38,50±0,42	68,00±7,46**,***
IL-4	23,5±2,4	23,00±0,24	26,00±0,32
IL-5	9,5±1,3	9,80±0,12	9,50±0,24
IL-6	122,5±9,7	66,50±0,60*	96,50±0,84**,***
IL-7	12,5±1,6	11,5±0,5	12,00±0,05
TNFα	16,2±1,9	21,50±0,60*	23,00±0,42**
IL-8	320,9±14,5	262,50±1,32*	347,80±3,43
MCP-1	12,4±1,9	13,30±0,12	13,50±0,24
MIP-1β	1492,8±72,7	976,0±107,4*	1663,0±21,6

Примечание.* – достоверность отличий между группами Ген spА+ от Контроля, ** – достоверность отличий между группами Ген spА- от Контроля, *** – достоверность отличий Ген spА+ от Ген spА- (р < 0,05).

Note.*, the reliability of the differences between the groups of the spА+ Gene from the Control; **, the reliability of the differences between the groups of the spА- Gene from the Control; ***, the reliability of the differences between the spА+ Gene from the spА- Gene (p < 0.05).

 

В проведенном исследовании установлено, что стафилококки, обладающие высокой степенью циткиноподобной активности, независимо от наличия или отсутствия у них гена spА, влияют на способность нейтрофилов секретировать цитокины. При этом S. aureus, имеющие ген spА, усиливают секрецию IL-1β, TNFα, IL-6 (провоспалительные цитокины), но при этом снижали секрецию IL-8, MIP-1β (хемокины). S. aureus, у которых нет генов к spА, обладают более разнообразным по спектру и силе воздействием на секрецию цитокинов нейтрофилами провоспалительных цитокинов, таких как IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-1β, IL-2, TNFα и росткового фактора G-CSF. Оба варианта стафилококков снижали секрецию IL-6. Эти данные свидетельствуют о нескольких очень важных аспектах. Во-первых наличие или отсутствие генов белка А у стафилококков, способных к секреции цитокиноподобных веществ, не влияет на их способность к стимуляции провоспалительных цитокинов, даже наоборот, отсутствие гена к белку А стимулирует увеличение спектра провоспалительных цитокинов. Во-вторых, наличие гена белка А у S. aureus вызывает снижение активности хемокинов и IL- 6, ключевых факторов активации фагоцитов. Все это говорит о наличии неизвестных ранее механизмов воздействия этих бактерий на цитокинопродукцию нейтрофилов. Поэтому в дальнейшем необходимо рассмотреть влияние супернатантов этих бактерий на секрецию нейтрофилами цитокинов, так как именно с супернатантами S. aureus и связана цитокиноподобная активность этих бактерий.

Выводы

1. S. aureus, имеющие ген spА, усиливают секрецию IL-1β, TNFα, IL-6 (провоспалительные цитокины), но при этом снижают секрецию IL-8, MIP-1β (хемокины) нейтрофилами.
2. S. aureus, у которых нет генов к spА, обладают более разнообразным по спектру и силе воздействием на секрецию цитокинов нейтрофилами провоспалительных цитокинов, таких как IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-1β, IL-2, TNFα и росткового фактора G-CSF.
3. Оба варианта стафилококков, с наличием или отсутствием генов spА, снижали секрецию IL-6 нейтрофилами.

Об авторах

Л. О. Фомина

ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» Уральского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: fomina454@yandex.ru

аспирант

Россия, Екатеринбург

В. А. Гриценко

ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Email: fomina454@yandex.ru

д.м.н., профессор, главный научный сотрудник

Россия, Оренбург

А. И. Файзуллина

ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» Уральского отделения Российской академии наук

Email: fomina454@yandex.ru

аспирант

Россия, Екатеринбург

Список литературы

Дополнительные файлы