Влияние наночастиц оксида графена на жизнеспособность клеток гибридомы BAP3

Полный текст

Введение

Благодаря своим уникальным свойствам графен все чаще находит применение в биомедицине. В частности, оксид графена (ОГ) в настоящее время исследуется для применения в таких сферах биомедицины, как доставка лекарств и медицинская визуализация [5]. Применение материалов на основе графена в медицине требует тщательной оценки их биосовместимости и детального понимания их взаимодействия с клетками. Как известно, различные поверхностные модификации ОГ могут снижать цитотоксические эффекты в отношении клеток [2]. Кроме того, одним из самых распространенных материалов для функционализации ОГ является полиэтиленгликоль (ПЭГ) [6]. В нашей работе мы использовали частицы ОГ, модифицированного разветвленным и неразветвленным ПЭГ.

Данное исследование является частью большого проекта по изучению биосовместимости наночастиц ОГ с клетками иммунной системы [https://grant.rscf.ru/prjcard_int?19-15-00244]. Гибридомы используются для продукции моноклональных антител определенной специфичности. Гибридома BAP3 (Genovac, Германия) была получена из плазматических клеток селезенки мыши и продуцирует IgG к трофобластическому бета-1-гликопротеину человека. Известно, что клетки гибридомы быстро пролиферируют и обладают характеристиками, сходными с плазматическими клетками мыши [4]. Таким образом, они представляют собой адекватную модель для изучения влияния различных веществ на плазматические клетки.

Целью нашего исследования стало изучение процессов взаимодействия наночастиц ОГ с клетками гибридомы BAP3 в условиях in vitro. В работе применяли наночастицы разного размера, функционализированные линейным или разветвленным ПЭГ, изучая как жизнеспособность клеток, так и поглощение частиц этими клетками.

Материалы и методы

Функционализация наночастиц ОГ

В работе использовались наночастицы ОГ размерами 100-200 нм (ОГм) и 1-5 мкм (ОГб) (Ossila Ltd, Великобритания), которые покрывались линейным (П) и разветвленным (рП) полиэтиленгликолем (ПЭГ). Процедуры модификации и характеристика наночастиц описаны нами ранее [3]. Таким образом, в работе применялись следующие частицы: П-ОГм (Ø 184±73 нм), рП- ОГм (Ø 287±52 нм), П-ОГб (Ø 569±14 нм), рП-ОГб (Ø 1376±48 нм).

Подготовка культуры клеток гибридомы BAP3

Для исследования in vitro использовали клетки гибридомы ВАР3 (Genovac, Германия), производящей IgG, специфичные к трофобластическому бета-1-гликопротеину человека. Клетки гибридомы BAP3 хранили в криохранилище при температуре жидкого азота (количество клеток в каждой пробирке – 3-5 × 10⁶) в среде заморозки (эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС) (BI, Израиль) + 10% диметилсульфоксид (ДМСО) (Sigma, США)). Клетки были разморожены согласно протоколу производителя (Genovac, Германия). После размораживания клетки были перенесены в 48-луночный планшет (Сorning, США) для культивирования в средe роста (среда DMEM с высоким содержанием глюкозы (BI, Израиль) + 12% (ЭТС) (BI, Израиль)) в течение 48 часов в СО₂-инкубаторе IG-150 Jouan (Франция) при концентрации СО₂ 5%. После этого клетки были перенесены в T75 культуральные фласки (Cellstar^®, Германия) с бессывороточной средой DCCM-1 (BI, Израиль) с добавлением 3,3 мМ L-глутамина, 67 Ед/мл пенициллина, 0,07 мг/мл стрептомицина, 0,17 мкг/мл амфотерицина B, 1 мМ пирувата натрия (BI, Израиль).

Клетки культивировали во фласках в течение недели для формирования стабильной культуры перед внесением наночастиц ОГ. Ежедневно проводили подсчет количества клеток, проверяли их жизнеспособность, при необходимости производили замену среды. Подсчет и проверку жизнеспособности клеток осуществляли в гемоцитометре Нейбауэра, в тесте с трипановым синим (0,2%; Sigma, США).

Оценка взаимодействия клеток гибридомы с наночастицами ОГ

Для оценки влияния ОГ на жизнеспособность гибридомы BAP3, клетки вносили в концентрации 2 × 10⁵ кл/мл в 48-луночные планшеты (Сorning, США). Далее в лунки добавляли наночастицы ОГ разных размеров, функционализированные линейным или разветвленным ПЭГ (П-ОГм, рП-ОГм, П-ОГб, рП-ОГб) до конечных концентраций 5 и 25 мкг/мл. Культуры инкубировали в течение суток при 37 °C и 5% CO₂ (для оценки влияния ОГ на жизнеспособность клеток гибридомы). Для каждого вида наночастиц ОГ делали три повторности культуры, контролем служила культура клеток без наночастиц ОГ.

После инкубации была произведена оценка жизнеспособности клеток с помощью суправитального красителя Zombie Aqua (ZA) на проточном цитометре (Cytoflex S, Beckman Coulter, США). Кроме того, оценивали количество клеток, интернализовавших (адгезировавших) наночастицы ОГ, по интенсивности флуоресценции клеток (λex = 488 nm; bandpass filter: 720-840 nm; фильтр для красителя PC-7). Также нами была использована система визуализации (EVOS M5000, Thermo Fisher Scientific, США) для получения снимков каждого типа культур в лунках.

Обработку данных проточной цитометрии осуществляли в программе KALUZA Analysis Software (Beckman Coulter, США), результаты выражали в виде процента живых (не окрашенных Zombie Aqua) клеток в гейте целевой популяции, и в виде процента клеток, флуоресцирующих в канале для красителя PC-7 (при оценке интернализации/адгезии) наночастиц.

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью Graphpad Prism 8. Данные представлены в арифметических средних со стандартными отклонениями (M±σ), достоверность различий оценивали с использованием критерия ANOVA с тестом для множественных сравнений Сидака. Различия считались достоверными при уровне значимости р < 0,05. Для частиц в высокой концентрации был вычислен коэффициент R² (Пирсона) для корреляции между размером частиц и долей жизнеспособных клеток.

Результаты и обсуждение

1. Обнаружено, что частицы П-ОГм в низкой и высокой концентрациях действовали цитотоксически на клетки гибридомы BAP3, так как количество живых клеток в культурах статистически значимо снижалось (рис. 1А). Остальные частицы оказывали цитотоксический эффект только в высокой концентрации 25 мкг/мл. Интересно, что ОГ в высокой концентрации, функционализированный разветвленным ПЭГ (рП-ОГм и рП-ОГб), оказывал меньший цитотоксический эффект по сравнению с ОГ, покрытым линейным ПЭГ (рис. 1А).

Таким образом, наночастицы ОГ способны оказывать цитотоксический эффект на клетки гибридомы BAP3 в высокой концентрации (25 мкг/ мл), независимо от размера и типа ПЭГ, которыми они покрыты. В то же время только частицы малого размера (П-ОГм) способны оказывать цитотоксический эффект в низкой концентрации (5 мкг/мл). Для частиц в высокой концентрации коэффициент R² для корреляции между размером частиц и долей жизнеспособных клеток в культуре равен 0,83 (p < 0,05). Цитотоксичность частиц уменьшается с увеличением их размера.

 

Рисунок 1. Взаимодействие наночастиц ОГ с клетками гибридомы

Примечание. А – процент жизнеспособных клеток в культурах гибридомы BAP3 с разными видами наночастиц ОГ в двух концентрациях. Для всех групп n = 3. Числами обозначены значения p < 0,05 по отношению к контролю без ОГ и по отношению к частицам ОГ, покрытым неразветвленным ПЭГ.

Б – Процент флуоресцирующих (интернализовавших/адгезирующих ОГ) клеток в суточных культурах клеток гибридомы BAP3. Для всех групп n = 3. Числами обозначены значения p < 0,05 (ANOVA) показателей культур с большими наночастицами ОГ по отношению к культурами с малыми наночастицами ОГ с аналогичным покрытием (видом ПЭГ).

Figure 1. Interaction of GO nanoparticles and hybridoma cells

Note. (A) Percentage of viable BAP3 hybridoma cells in cultures with different types of GO nanoparticles added in two concentrations. For all groups n = 3. P-values < 0.05 as compared to the control group and to the GO nanoparticles functionalized with linear PEG are indicated by numbers.

(B) Percentage of cells exhibiting fluorescense in 24 h BAP3 hybridoma cell cultures. Note: for all groups n = 3. P-values indicate the difference (ANOVA) between samples with large nanoparticles and samples with small nanoparticles of the same PEG coating type.

 

При оценке интернализации (адгезии) частиц клетками гибридомы BAP3 обнаружено, что в концентрации 5 мкг/мл частицы практически не интернализовались, однако концентрация наночастиц ОГ 25 мкг/мл способствовала их интенсивной интернализации (адгезии) клетками гибридомы, о чем говорит повышение процента флуоресцирующих клеток (рис. 1Б). Однако тип ПЭГ, использованный для покрытия частиц ОГ, не влиял на этот параметр. Известно, что опухолевые линии клеток, могут интернализовать наночастицы различными способами [1]. Статистически значимые различия в процентах флуоресцирующих клеток между культурами с ОГ с одинаковым покрытием, но разными размерами, говорит о том, что мелкие частицы клетками гибридомы адгезируются/интернализуются лучше, чем большие (рис. 1Б). Цитотоксический эффект наночастиц мы связываем с ER-стрессом, вызванный интернализацией наночастиц клетками гибридомы.

 

Рисунок 2. Визуализация взаимодействия клеток гибридомы BAP3 и наночастиц ОГ

Примечание. П – линейный ПЭГ, рП – разветвленный ПЭГ, ОГм – частицы малого размера, ОГб – частицы большого размера.

Figure 2. Visualization of interaction between BAP3 hybridoma and GO nanoparticles

Note. P, linear PEG; bP, branched PEG; GOs, small particles; GOb, large particles.

 

Заключение

При изучении влияния наночастиц ОГ на клетки гибридомы BAP3 было показано, что частицы оказывали цитотоксический эффект в высокой концентрации 25 мкг/мл, при этом цитотоксический эффект уменьшался с увеличением размера частиц. При оценке интернализации (адгезии) частиц клетками гибридомы BAP3 обнаружено, что в концентрации 5 мкг/мл частицы практически не интернализовались, однако, концентрация наночастиц ОГ 25 мкг/мл способствовала их интенсивной интернализации (адгезии) клетками гибридомы. Таким образом, полученные данные позволяют связать оказываемый наночастицами ОГ цитотоксический эффект с их интернализацией (адгезией) клетками. В целом впервые изучены некоторые аспекты взаимодействия наночастиц ОГ с клетками гибридомы.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РНФ в рамках научного проекта № 19-15-00244-П.

Об авторах

С. С. Лазарев

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» УрО РАН; ФГАОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: lasest@vk.com

инженер лаборатории экологической иммунологии; бакалавр кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета

Россия, Пермь; Пермь

М. C. Бочкова

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» УрО РАН; ФГАОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

Email: lasest@vk.com

к.б.н., научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии; старший преподаватель кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета

Россия, Пермь; Пермь

В. П. Тимганова

ФГАОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

Email: lasest@vk.com

к.б.н., научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии

Россия, Пермь

М. Б. Раев

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» УрО РАН; ФГАОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

Email: lasest@vk.com

д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии; профессор кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета

Россия, Пермь; Пермь

Список литературы

Дополнительные файлы