Экспрессия эктонуклеотидаз CD39 и CD73 в популяциях CD4+ лимфоцитов у условно здоровых детей

Полный текст

Введение

В последнее десятилетие интенсивно изучается пуринергическая система регуляции иммунной системы. Пуринергическая система оказывает существенное влияние на межклеточные взаимодействия, секрецию цитокинов и хемокинов, образование активных форм кислорода, шеддинг поверхностных антигенов, осуществляя таким образом точную «настройку» иммунной системы [4]. АТФ и аденозин являются пуринергическими медиаторами, которые высвобождаются во внеклеточное пространство в ответ на разного рода нарушения, в том числе метаболические, и действуют как сенсорные и эфферентные сигналы для формирования иммунных ответов [13, 14, 15]. Молекула АТФ в зависимости от концентрации может действовать как иммуностимулятор и как иммунодепрессант, в то же время аденозин выполняет только функцию иммуносупрессора. Практически все иммунные клетки экспрессируют рецепторы P2 и P1, с которыми взаимодействуют АТФ и аденозин соответственно. Таким образом, пуринергическая система участвует в регуляции всех звеньев иммунной системы [8].

Ключевыми молекулами пуринергической системы регуляции являются эктонуклеотидазы CD39 и CD73 – ферменты, под действием которых АТФ в ходе последовательных реакций гидролизуется до аденозина. После высвобождения АТФ во внеклеточное пространство CD39 (экто-нуклеозидтрифосфатдифосфогидролаза 1, E-NTPDase1) превращает АТФ в AMP, а затем CD73 (экто-5’-нуклеотидаза, Ecto5’NTase) дефосфорилирует AMP в аденозин. Экспрессия CD39 и CD73 на лимфоцитах претерпевает динамические изменения при различных патологических процессах: инфекции, СПИД, аутоиммунные заболевания, атеросклероз, ишемически-реперфузионное повреждения, онкологические заболевания [5, 6, 10, 12].

В последние годы большое внимание уделяется изучению экспрессии эктонуклеотидаз при патологических состояниях, но работ, посвященных изучению CD39 и CD73 у здоровых людей, крайне мало. Так было показано, что у взрослых доноров CD39 конститутивно экспрессируется на более чем 90% В-клеток, более 90% моноцитов, на 20-30% CD4⁺Т-клеток (включая Т-клетки памяти и Treg), менее 5% CD8⁺Т-клеток и на 2-5% NK-клеток. CD73 экспрессируется на 75% В-клеток, 50% CD8⁺Т-клеток, 10% CD4⁺Т-клеток и 2-5% NK-клеток [11]. Показано также, что В-клетки, Treg, Th17-клетки, NK-клетки и супрессорные клетки миелоидного происхождения могут коэкспрессировать CD39 и CD73 [3]. Описано, что экспрессия CD39 и CD73 у взрослых зависит от популяции Т-лимфоцитов и от возраста человека [1]. Например, количество клеток, экспрессирующих CD73 на лимфоцитах снижается с возрастом [9]. Исследования по изучению количества клеток, экспрессирующих CD39 и CD73 у здоровых детей, не проводились. В связи с этим цель настоящего исследования – изучить особенности экспрессии CD39 и CD73 в различных субпопуляциях CD4⁺ лимфоцитов у условно здоровых детей разного возраста.

Материалы и методы

Было обследовано 45 условно здоровых детей в возрасте 12,4 (10-16,1) лет. Критериями исключения являлись: наличие в стандартном клиническом и/или биохимическом лабораторном исследовании результатов, выходящих за диапазон референсных значений; наличие каких-либо острых состояний или обострения хронических; наличие в анамнезе травм, аутоиммунных, онкологических и психических заболеваний.

Обследование пациентов проводилось согласно этическим нормам и регулирующим документам Российской Федерации. Исследование получило одобрение локального этического комитета. Перед исследованием было получено информированное согласие родителей в соответствии с Хельсинкской декларацией. Образцы венозной крови для иммунологических тестов получали путем забора из локтевой вены натощак в пробирки BDVacutainer^® с антикоагулянтом К₂ЭДТА.

Иммунофенотипирование лимфоцитов и оценка количества клеток, экспрессирующих рецепторы пуринергического сигналинга (СD39 и CD73), в популяциях Т-клеток проводили методом проточной лазерной цитофлуориметрии (Novocyte, ACEA Biosciences, США). Использовали панель моноклональных антител, конъюгированных с различными флюорохромами: CD4-FITC (cat. A07750, Beckman Coulter, США), CD127-PE (cat. IM 10980U, Beckman Coulter, США), CD25-PC7 (cat. A52882, Beckman Coulter, США), CD161-PE (cat. IM 3450, Beckman Coulter, США), CD3-PC5 (cat. A07749, Beckman Coulter, США), CD39-APC-Cy7 (Clone A1, cat. RT2241130 Sony Biotechnology, США), CD73-APC-Cy7 (Clone AD2, cat. RT2320110, Sony Biotech- nology, США). Количесто клеток с CD39⁺ и CD73⁺ в регуляторных Т-клетках (CD4⁺CD25^highCD127^low), активированных Т-хелперах (Tact – CD4⁺CD25⁺CD127^high), Th17-лимфоцитах (CD4⁺CD161⁺CD3⁺) оценивали с помощью пошагового гейтирования. Тактика гейтирования для выделения Тreg и Tact, несущих CD39 и CD73, следующая: 1 – выделение «лимфоидного» региона по параметрам прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния; 2 – выделение CD4 позитивных лимфоцитов; 3 – выделение Treg по маркерам (CD4⁺CD25^highCD127^low); 4 – выделение Tact по маркерам (CD4⁺CD25^highCD127^high); 5 – далее в составе выделенных регионов оценивался процент клеток, экспрессирующих CD39 и CD73: субпопуляции CD39⁺Treg, CD73⁺Treg, CD39⁺Tact, CD73⁺Tact.

Тактика гейтирования для выделения Тh17, несущих CD39 и CD73, следующая: 1 – выделение «лимфоидного» региона по параметрам прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния; 2 – выделение двойной позитивной популяцию по маркерам CD3 и CD4; 3 – выделение Th17-популяции (CD3⁺CD4⁺CD161⁺); 4 – далее в составе выделенных регионов оценивался процент клеток, экспрессирующих CD39 и CD73: субпопуляции CD39⁺Th17, CD73⁺Th17.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica 7.0 (StatSoft, США). Описательная статистика количественных признаков представлена в формате: медиана (нижние и верхние квартили) – Me (Q_0,25-Q_0,75). Достоверность различий между группами оценивали с использованием непараметрического U-критерия Манна–Уитни. Для выявления связи между исследованными показателями и возрастом использовали коэффициент корреляции Пирсона (r). Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Было проанализировано количество клеток, экспрессирующих CD39⁺ и CD73⁺ в популяциях Т-лимфоцитов у детей. Наибольшее количество CD39⁺ отмечалось в популяции Treg и колебалось от 19% до 49%. Зарубежными авторами было показано, что у взрослых здоровых доноров этот показатель варьировал от 10% до 60% [7]. Относительное количество клеток, несущих CD73, в популяции Tact у обследованных детей составляло от 7% до 35%. Сравнение популяций лимфоцитов, несущих CD39 и CD73, показало, что наибольший процент CD39⁺ клеток наблюдался в Treg, а в Tact наоборот количество клеток с CD73⁺ достоверно превалировало над CD39⁺ (табл. 1, рис. 1). Что касается популяции Th17-лимфоцитов, то достоверной разницы между количеством клеток, экспрессирующих CD39 и CD73 выявлено не было.

 

ТАБЛИЦА 1. ОТНОСИТЕЛЬНОЕ И АБСОЛЮТНОЕ КОЛИЧЕСТВО КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ЭКТОНУКЛЕОТИДАЗЫ CD39 И CD73 В ПОПУЛЯЦИЯХ Т-ЛИМФОЦИТОВ У УСЛОВНО ЗДОРОВЫХ ДЕТЕЙ, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 1. RELATIVE NUMBER AND ABSOLUTE COUNT OF CELLS EXPRESSING CD39 AND CD73 ECTONUCLEOTIDASES IN POPULATIONS OF T LYMPHOCYTES IN HEALTHY CHILDREN, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Популяции Populations	Ферменты Enzymes		p
	CD39	CD73
% от Treg % from Treg	34,2 (27,2-39,1)	8,7 (6,9-12,5)	0,000
Treg, кл/мкл Treg cells/ μl	26,5 (18,2-30,9)	7,3 (3,1-9,7)	0,000
% от Tact % from Tact	5 (4,4-7,6)	17,6 (11,9-21,5)	0,000
Tact, кл/мкл Tact cells/μl	6,8 (5,5-8,8)	23,5 (13,7-31,5)	0,000
% от Th17 % from Th17	9,7 (8,6-12,1)	10,2 (7,3-14,4)	1,000
Th17, кл/мкл Th17, cells/μL	12,2 (11,4-14,4)	12,7 (8,6-17,6)	0,900

 

Рисунок 1. Относительное количество клеток, экспрессирующих CD39 и CD73, в популяциях Treg, Tact, Th17

Figure 1. Relative number of cells expressing CD39 and CD73 in Treg, Tact, Th17 populations

 

Корреляционный анализ зависимости популяций Т-лимфоцитов от возраста показал, что относительное количество Treg не зависело от возраста (r = -0,15; p = 0,328), а абсолютное количество Treg снижалось с возрастом (r = -0,45; p = 0,002). Относительное количество Th17 с возрастом увеличивалось (r = 0,47; p = 0,002), при этом абсолютное количество от возраста не зависело (r = -0,06; p = 0,708). Что касается активированных Т-хелперов, то относительное (r = 0,86; p = 0,000) и абсолютное (r = 0,63; p = 0,000) их количество увеличивалось с возрастом. Представленные результаты согласуются с ранее полученными данными в более широком возрастном диапазоне [2].

Получены различия в возрастной динамике содержания малых популяций лимфоцитов (Treg, Th17, Tact) и клеток, экспрессирующих CD39 и CD73. Так, относительное количество СD39⁺Treg не изменялось с возрастом, так же как и общее количество Treg, при этом относительное количество СD73⁺Treg достоверно снижалось с возрастом (табл. 2).

 

ТАБЛИЦА 2. ЗАВИСИМОСТЬ ЭКСПРЕССИИ CD39 И CD73 ОТ ВОЗРАСТА В ПОПУЛЯЦИЯХ Т-КЛЕТОК У УСЛОВНО ЗДОРОВЫХ ДЕТЕЙ (ПО ПРОЦЕНТАМ И АБСОЛЮТНЫМ ПОКАЗАТЕЛЯМ)

TABLE 2. DEPENDENCE OF CD39 AND CD73 EXPRESSION FROM AGE IN T CELL POPULATIONS IN HEALTHY CHILDREN (BY PERCENTAGE AND ABSOLUTE COUNT)

Популяции Populations	Возраст Age	Фермент Enzymes
		СD39	CD73
	Относительное количество, % Relative numbers, %
Treg	r = -0,15; p = 0,328	r = 0,16; p = 0,290	r = -0,51; p = 0,000
Th17	r = 0,47; p = 0,002	r = -0,40; p = 0,006	r = 0,42; p = 0,004
Tact	r = 0,86; p = 0,000	r = -0,49; p = 0,000	r = 0,16; p = 0,294
	Абсолютное количество, кл/мкл Abs, cells/μL
Treg	r = -0,45; p = 0,002	r = -0,44; p = 0,002	r = -0,67; p = 0,000
Th17	r = -0,06; p = 0,708	r = -0,44; p = 0,003	r = 0,35; p = 0,190
Tact	r = 0,63; p = 0,000	r = -0,13; p = 0,391	r = 0,47; p = 0,001

 

Абсолютное количество клеток СD39⁺Treg и СD73⁺Treg достоверно снижалось с возрастом, так же как и абсолютное количество Treg. Для популяции Th17 получено, что относительное количество CD73⁺Th17 с возрастом увеличивалось, повторяя возрастную динамику общей популяции Th17, а относительное количество СD39⁺Th17 с возрастом снижалось. Интересно отметить, что популяция Th17, экспрессирующая эктонуклеотидазу СD39, относится к супрессорной субпопуляции – supTh17; снижение с возрастом уровня клеток этой субпопуляции согласуется с возрастной динамикой снижения уровня Treg. Для большинства исследованных субпопуляций (Treg, СD39⁺Treg, СD73⁺Treg, СD39⁺Th17) выявлена динамика умеренного снижения абсолютных чисел с возрастом, что согласуется с известной возрастной динамикой снижения абсолютного уровня всех лимфоцитов и CD4⁺ в том числе. В связи с этим мы предполагаем, что анализ абсолютных чисел имеет меньшее значение по сравнению с относительными показателями, которые позволяют оценивать равновесие субпопуляций. Возрастная динамика повышения абсолютных чисел CD73⁺Tасt и всей популяции Tact отличалась от других субпопуляций лимфоцитов, что вызывает определенный интерес для дальнейшего изучения.

Заключение

Оценка количества клеток малых популяций CD4⁺ лимфоцитов, экспрессирующих эктонуклеотидазы CD39 и CD73, показала, что уровень экспрессии зависит от конкретной субпопуляции клеток. Наибольшее количество клеток, несущих CD39, наблюдалось в популяции Treg, а наибольшее количество клеток, несущих CD73 – в популяции Tact, что отражает особенности пуринергической регуляции данных популяций. У детей, так же как и у взрослых, наблюдается большая вариабельность показателей, однако для ряда поверхностных маркеров показана существенная возрастная динамика. Наиболее выраженными изменениями с возрастом являются увеличение относительного количества Th17-клеток, экспрессирующих СD73, и снижение относительного количества Th17 и Tact, экспрессирующих CD39. Описанные особенности эктонуклеотидаз на малых популяциях CD4⁺ лимфоцитов должны учитываться при проведении исследований у детей разных возрастных групп c иммуноопосредованными заболеваниями.

Об авторах

Т. В. Радыгина

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей» Министерства здравоохранения РФ

Автор, ответственный за переписку.
Email: radigina.tv@nczd.ru

к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной иммунологии и вирусологии

Россия, Москва

Д. Г. Купцова

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей» Министерства здравоохранения РФ

Email: radigina.tv@nczd.ru

младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной иммунологии и вирусологии

Россия, Москва

С. В. Петричук

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей» Министерства здравоохранения РФ

Email: radigina.tv@nczd.ru

д.б.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории экспериментальной иммунологии и вирусологии лабораторного отдела НИИ педиатрии

Россия, Москва

Е. Л. Семикина

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей» Министерства здравоохранения РФ; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский университет)

Email: radigina.tv@nczd.ru

д.м.н., главный научный сотрудник лаборатории экспериментальной иммунологии и вирусологии, заведующий лабораторным отделом; профессор кафедры педиатрии и детской ревматологии 

Россия, Москва; Москва

А. П. Фисенко

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей» Министерства здравоохранения РФ

Email: radigina.tv@nczd.ru

д.м.н., профессор, директор

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы