Влияние синтетического аналога активного центра ГМ-КСФ – пептида ZP2 – на антицитокиновую активность бактерий рода Enterococcus и их способность к продукции цитокиноподобных веществ

Полный текст

Введение

Бактерии рода Enterococcus широко распространены в природе. Они являются как представителями нормальной микрофлоры пищеварительного тракта человека, млекопитающих, птиц, рептилий, насекомых, обеспечивая колонизационную резистентность кишечного биотопа, так и возбудителями многих инфекционно-воспалительных заболеваний человека и животных [1].

Развитию энтерококковых инфекций способствует наличие у изолятов факторов патогенности и персистенции [2, 13, 14], которые оказывают влияние на характер течения и длительность подобных инфекционно-воспалительных заболеваний. Нельзя исключить, что антицитокиновая активность (АЦА) энтерококков и их способность продуцировать цитокиноподобные вещества (ЦПВ) могут оказывать влияние на локальный цитокиновый баланс, поддерживающий воспалительный процесс [3, 15].

В этой связи актуален поиск препаратов с антиперсистентной активностью. Такими препаратами могут быть пептиды естественного и искусственного происхождения.

Пептид ZP2 – синтетический аналог активного центра гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) обладает широким спектром биологического действия [5, 7]. В том числе известно о модифицирующих эффектах синтетического пептида ZP2 на способность S. aureus формировать биопленки [4], а также показано его влияние на продукцию данными микроорганизмами цитокиноподобных веществ [6, 8].

Все вышеизложенное указывает на актуальность изучения влияния синтетического пептида ZP2 на биологические свойства бактерий рода Enterococcus, в частности на их антицитокиновую активность, т. е. способность инактивировать различные цитокины, а также на продукцию этими микроорганизмами цитокиноподобных веществ.

Цель исследования – проанализировать характер влияния синтетического аналога ГМ-КСФ – пептида ZP2 на антицитокиновую активность и способность к продукции цитокиноподобных веществ у бактерии рода Enterococcus, выделенных из секрета простаты у мужчин с симптомами урогенитальной инфекции.

Материалы и методы

В эксперименте использовано 18 клинических штаммов бактерий рода Enterococcus (по 9 штаммов E. faecalis и E. faecium), выделенных из секрета предстательной железы у мужчин с симптомами урогенитальной инфекции. Выделение бактерий из исследуемого материала проводили общепринятыми бактериологическими методами. Видовую принадлежность микроорганизмов оценивали с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF серии Microflex (Bruker Daltonics, Германия), идентификацию микроорганизмов с расчетом коэффициента достоверности проводили с использованием программного обеспечения Maldi BioTyper 3,0.

Для изучения влияния ZP2 на АЦА изолятов Enterococcus и продукцию ими ЦПВ проводили культивирование 1 мл взвеси бактерий в физиологическом растворе с 1 мл раствора ZP2 с концентрацией 0,1 мкг/мл в 2 мл бульона Шедлера при 37 °С в течение 24 ч. Контролем служили пробы без добавления раствора ZP2. Затем контрольные и опытные пробы центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин, сливали надосадочную жидкость, добавляли к осадку 2 мл бульона Шедлера и ресуспензировали.

АЦА в отношении IL-8, TNFα и IL-17А и продукцию соответствующих ЦПВ определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по известной методике [3] в оригинальной модификации с использованием наборов ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург). Для этого в центрифужные пробирки вносили в соотношении 1:1 взвесь бактерий рода Enterococcus и растворы соответствующих цитокинов, пробы инкубировали в течение 2 часов при 37 °С. После инкубации бактерий с цитокинами реакцию останавливали на холоде, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин (+4 °С) и отбирали супернатанты. В качестве контроля использовали растворы цитокинов в физиологическом растворе. Конечная концентрация цитокинов в опытных и контрольных пробах составляла для IL-8 – 50 пг/мл, TNFα – 25 пг/мл, IL-17А – 75 пг/мл. Результаты учитывали на фотометре StatFax 2100 (США) при длине волны 450 нм. Для оценки АЦА урогенитальных изолятов бактерий рода Enterococcus вычисляли долю инактивации цитокинов в опыте относительно контроля и выражали в пг/ мл; о продукции бактериями рода Enterococcus ЦПВ судили по уровню цитокинов в опыте по сравнению с контролем и выражали в пг/мл. Данные были обработаны методами вариационной статистики [11].

Результаты и обсуждение

Полученные в ходе исследования данные свидетельствовали, во-первых, о том, что бактерий рода Enterococcus способны секретировать соединения, инактивирующие цитокины IL-8, IL- 17А и TNFα, т. е. проявлять в отношении них антицитокиновую активность – АЦА (табл. 1), а также могут продуцировать в среду культивирования цитокиноподобные вещества – ЦПВ (табл. 2). При этом наблюдалась внутриродовая, (межвидовая) и внутривидовая (межштаммовая) вариабельность бактерий рода Enterococcus как по наличию и частоте встречаемости, так и по выраженности указанных свойств.

У бактерий рода Enterococcus АЦА выявлялась в отношении всех изученных цитокинов. Наиболее часто энтерококки были способны инактивировать TNFá (66,7±11,1%) и IL-8 (50,0±11,8%), значительно реже – IL-17A (33,3±11,1%), экспрессия признака составила 2,1±0,3; 5,2±0,3 и 4,2±0,3 пг/мл соответственно (табл. 1). При этом распространенность АЦА в отношении IL-8 и TNFα была значительно выше у изолятов E. faecalis , чем у E. faecium с достоверно более высокой экспрессией признака (p < 0,01).

Кроме того у бактерий рода Enterococcus выявлена способность к продукции ЦПВ. Так, энтерококки продуцировали вещества, подобные интерлейкину IL-17А в 33,3±11,1% случаев, а вещества, подобные IL-8 и TNFα в 2 раза реже – в 16,7±8,8% случаев. При этом экспрессия продукции веществ подобных IL-17А так же была выше – 6,2±0,4 пг/мл, а уровень продукции IL-8 и TNFα составил 4,5±0,1 пг/мл и 1,4±0,1 пг/мл соответственно. ЦПВ, подобные интерлейкину IL-17А были способны продуцировать как E. faecalis, так и E. faecium, а подобные IL-8 и TNFα – только изоляты E. faecium.

В результате проведенных экспериментов in vitro по изучению влияния синтетического аналога активного центра гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) – пептида ZP2 на антицитокиновую активность и способность к продукции цитокиноподобных веществ у бактерий рода Enterococcus было установлено, что пептид ZP2 достоверно увеличивал частоту выявления АЦА в отношении IL-8 с 50,0±11,8% до 83,3±8,8% (p < 0,05) и полностью ингибировал способность к продукции веществ подобных IL-8 (табл. 1).

 

ТАБЛИЦА 1. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА ZP2 НА АНТИЦИТОКИНОВУЮ АКТИВНОСТЬ (АЦА) БАКТЕРИЙ РОДА ENTEROCOCCUS

TABLE 1. EFFECT OF PEPTIDE ZP2 ON THE ANTICYTOKINE ACTIVITY (АСА) OF ENTEROCOCCUS

АЦА против цитокинов АСА vs сytokines	E. faecalis (n = 9)		E. faecium (n = 9)		Всего Total (n = 18)
	Распространенность, % Prevalence, %
	Контроль Control	Опыт Experience	Контроль Control	Опыт Experience	Контроль Control	Опыт Experience
IL-17А	33,3±15,7	0	33,3±15,7	66,7±15,7	33,3±11,1	33,3±11,1
TNFα	100	100	33,3±15,7	33,3±15,7	66,7±11,1	66,7±11,1
IL-8	66,7±15,7	66,7±15,7	33,3±15,7	100**	50,0±11,8	83,3±8,8*
Выраженность, пг/мл Expression, pg/mL
	Контроль Control	Опыт Experience	Контроль Control	Опыт Experience	Контроль Control	Опыт Experience
IL-17А	4,7±0,1	0	3,7±0,3	7,1±0,4**	4,2±0,3	7,1±0,4**
TNFα	2,5±0,3	2,8±0,2**	1,0±0,1	1,9±0,1**	2,1±0,3	2,6±0,2
IL-8	5,6±0,2	6,0±1,7	4,3±0,1	7,7±1,6*	5,2±0,3	7,0±1,2

Примечание. * – p < 0,05; ** – p < 0,01.

Note. *, p < 0.05; **, p < 0.01.

 

При этом среди урогенитальных изолятов E. faecium пептид ZP2 увеличивал число штаммов, обладающих АЦА в отношении IL-8 в 3 раза (с 33,3±15,7 до 100%, p < 0,01), а в отношении IL- 17А в 2 раза (с 33,3±15,7% до 66,7±15,7%), с увеличением у них выраженности признака в 1,7- 1,9 раза (с 4,3±0,1 пг/мл до 7,7±1,6 пг/мл и с 3,7±0,3 пг/мл до 7,1±0,4 пг/мл соответственно). В то же время у изолятов E. faecalis пептид ZP2 полностью ингибировал АЦА только в отношении IL-17А, а в отношении других цитокинов достоверных изменений не выявлено.

С другой стороны, у изолятов E. faecalis после воздействия пептида ZP2 отмечено увеличение в 2 раза доли штаммов, способных продуцировать вещества подобные IL-17А (с 33,3±15,7% до 66,7±15,7%), при этом выраженность признака достоверно снижалась с 7,2±0,1 пг/мл до 5,6±0,6 пг/мл (табл. 2). В то же время у штаммов E. faecium пептид ZP2 блокировал способность к продукции веществ подобных IL-17А и IL-8, а в отношении продукции веществ, подобных TNFα, изменения распространенности не наблюдалось, но регистрировалось увеличение выраженности признака в 1,6 раза (с 1,4±0,1 пг/мл до 2,2±0,1 пг/мл, p < 0,01).

 

ТАБЛИЦА 2. ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА ZP2 НА СПОСОБНОСТЬ БАКТЕРИЙ РОДА ENTEROCOCCUS ПРОДУЦИРОВАТЬ ЦИТОКИНОПОДОБНЫЕ ВЕЩЕСТВА (ЦПВ)

TABLE 2. EFFECT OF PEPTIDE ZP-2 ON THE ABILITY OF ENTEROCOCCUS TO PRODUCE CYTOKINE-LIKE SUBSTANCES (CLS)

ЦПВ CLS	E. faecalis (n = 9)		E. faecium (n = 9)		Всего Total (n = 18)
	Распространенность, % Prevalence, %
	Контроль Control	Опыт Experience	Контроль Control	Опыт Experience	Контроль Control	Опыт Experience
IL-17А	33,3±15,7	66,7±15,7	33,3±15,7	0	33,3±11,1	33,3±11,1
TNFα	0	0	33,3±15,7	33,3±15,7	16,7±8,8	16,7±8,8
IL-8	0	0	33,3±15,7	0	16,7±8,8	0
Выраженность, пг/мл Expression, pg/mL
	Контроль Control	Опыт Experience	Контроль Control	Опыт Experience	Контроль Control	Опыт Experience
IL-17А	7,2±0,1	5,6±0,6*	5,3±0,1	0	6,2±0,4	5,6±0,6
TNFα	0	0	1,4±0,1	2,2±0,1**	1,4±0,1	2,2±0,1**
IL-8	0	0	4,5±0,1	0	4,5±0,1	0

Примечание. * – p < 0,05; ** – p < 0,01.

Note. *, p < 0.05; **, p < 0.01.

 

Заключение

В настоящем исследовании изучена способность бактерий рода Enterococcus секретировать соединения, инактивирующие цитокины IL-8, TNFα и IL-17А, а также охарактеризована их способность продуцировать некоторые цитокиноподобные вещества. Кроме того, проанализировано влияние синтетического аналога активного центра ГМ-КСФ – пептида ZP2 – на антицитокиновую активность и способность к продукции цитокиноподобных веществ у бактерии рода Enterococcus, выделенных из секрета простаты у мужчин с симптомами урогенитальной инфекции, и показано его модифицирующее действие на проявление энтерококками указанных свойств, в том числе, с учетом их видовой принадлежности.

Ранее была выявлена способность клинических изолятов S. aureus, E. faecalis, K. pneumoniae и E. coli экскретировать в культуральную среду цитокиноподобные вещества (ЦПВ) [5], а также был выявлен модифицирующий эффект синтетического пептида ZP2 на способность S. aureus формировать биопленки [4], и показано его влияние на продукцию стафилококками цитокиноподобных веществ (ЦПВ) [8].

В результате проведенных нами экспериментов установлено, что синтетический пептид ZP2 стимулирует АЦА E. faecium в отношении IL-8 и IL-17A и ингибирует активность у E. faecalis в отношении IL-17А, т. е. наблюдался видоспецифический модифицирующий эффект данного пептида. С другой стороны, воздействие пептида ZP2 на бактерии рода Enterococcus вызывало видоспецифические, разной направленности и степени выраженности эффекты в отношении продукции ими цитокиноподобных веществ. При этом пептид ZP2 вызывал увеличение доли урогенитальных штаммов E. faecalis, способных продуцировать вещества, подобные IL-17А, с одновременным уменьшением выраженности признака. У E. faecium пептид ZP2 полностью ингибировал способность к продукции веществ, подобных IL-8 и IL-17А, при этом отмечено увеличение в 1,6 раза экспрессии способности продуцировать вещества подобные TNFα. Наши результаты согласуются с ранее полученными данными [8], которые свидетельствуют о том, что при наличии в среде культивирования данного пептида у музейных штаммов E. faecalis регистрировалось снижение в супернатантах на 58,5-98,3% не только IL-17А-ЦПВ, но и других цитокинов (G-CSF, IFNγ, IL-12p70).

Выявленные межвидовые особенности энтерококков как по антицитокиновой активности в отношении изученных иммуномедиаторов, так и по их способности продуцировать цитокиноподобные вещества могут отражаться на характере взаимодействия энтерококков с макроорганизмом. Так, ранее был выявлен более высокий уровень выраженности АЦА в отношении IL-4, IL-8, IL-10 у изолятов энтерококков, выделенных при инфекционно-воспалительных заболеваниях, по сравнению с кишечными изолятами [9, 10, 12, 15], что свидетельствует о возможном влиянии их экзометаболитов на локальный цитокиновый баланс и поддержание воспалительного процесса.

Необходимо учитывать обнаруженное в экспериментах in vitro разнонаправленное модифицирующее действие синтетического пептида активного центра ГМ-КСФ – ZP2 – на способность энтерококков секретировать внеклеточные соединения, инактивирующие/нейтрализующие различные цитокины, и способность продуцировать в среду культивирования цитокиноподобные вещества. В этой связи требуется продолжить изучение биологического и патогенетического значения не только выявленных у бактерии рода Enterococcus характеристик, но и обнаруженных модифицирующих эффектов пептида ZP2.

Дальнейшие исследования антицитокиновой активности и способности к продукции цитокиноподобных веществ у бактерии рода Enterococcus, выделенных из секрета предстательной железы мужчин с симптомами урогенитальной инфекции, может выявить информативные параметры, пригодные для оценки степени тяжести и/или характера течения заболевания.

Об авторах

О. А. Пашинина

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук – структурное научное подразделение ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» УрО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: olga25mikro@mail.ru

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза

Россия, Оренбург

О. Л. Карташова

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук – структурное научное подразделение ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» УрО РАН

Email: olga25mikro@mail.ru

д.б.н., доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов

Россия, Оренбург

Т. М. Пашкова

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук – структурное научное подразделение ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» УрО РАН

Email: olga25mikro@mail.ru

д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов

Россия, Оренбург

В. А. Гриценко

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук – структурное научное подразделение ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» УрО РАН

Email: olga25mikro@mail.ru

д.м.н., профессор, главный научный сотрудник Института клеточного и внутриклеточного симбиоза

Россия, Оренбург

Список литературы

Дополнительные файлы