MicroRNA signature of leukocytes in the context of chronic systemic inflammation in vascular dementia

Full Text

Введение

Современная точка зрения свидетельствует, что хроническое низкоуровневое воспаление, наблюдаемое в ходе старения организма, выступает ключевым фактором риска активации резидентных клеток врожденной иммунной системы мозга (микроглии и астроцитов), вступающих на путь секреции классических цитокинов воспаления – IL-1β, IL-6, TNFα, внутри мозга. Последующая сверхактивация этих клеток приводит к развитию нейровоспаления, цереброваскулярных нарушений и когнитивной недостаточности, презентация которых является базовым и/или ко-ассоциированными симптомами нейродегенеративных заболеваний (НЗ), таких как болезнь Альцгеймера, сосудистая деменция, болезнь Паркинсона и других [3, 4, 8, 12].

Как отмечают авторы, несмотря на широкий спектр работ, посвященных НЗ, существует недостаток в понимании ряда вопросов, касающихся механизмов и инициации их развития: в частности, они могут развиваться без симптомов в течение 10-20 лет до их клинической манифестации; для них характерны общность коморбидов и перекрест синдромов, таких как когнитивная недостаточность, и все это осложняет дифференциальную диагностику НЗ и их лечение. К сожалению, на сегодня практически не существует лекарственных препаратов, которые могли бы замедлить или предотвратить прогрессию НЗ пожилого/старческого возраста, и малоинвазивных методов диагностики [3, 4]. В свете сказанного, остаются востребованными поиски новых периферических биомаркеров, не только для дифференциальной диагностики, но и мониторинга эффективности лекарственной терапии.

В настоящее время проводятся масштабные исследования по использованию в качестве таких биомаркеров микроРНК (miR). МикроРНК представляют собой эндогенные некодирующие РНК, длинной около 22 нуклеотидов. Известно, что более 60% всех протеин-кодирующих генов регулируется микроРНК. МикроРНК функционирует как посттранскрипционный регулятор генной экспрессии, запуская деградацию или репрессию трансляции матричной РНК. Индивидуальные микроРНК могут образовывать связь с сотнями различных матричных РНК, и, наоборот, каждая матричная РНК может регулироваться множеством микроРНК. Неправильная регуляция специфическими микроРНК приводит к различным заболеваниям, включая иммунные дисфункции и нейродегенеративные процессы [6].

Цель исследования – идентифицировать лейкоцитарную сигнатуру микроРНК при сосудистой деменции в сравнении со здоровой старостью и репродуктивным возрастом в контексте воспаления и когнитивной недостаточности.

Материалы и методы

В работе обследовано 54 человека от репродуктивного до старческого возраста. Основную группу составили 9 персон пожилого/старческого возраста (средний возраст – 81,4±2,0 года) с диагнозом по МКБ-10 – F 01 «Сосудистая деменция». В качестве первой контрольной группы включены лица соответствующего пола и возраста без выраженных когнитивных нарушений – группа «Здоровая старость», 21 человек, средний возраст – 79,3±1,1 год. Все персоны находились под постоянным наблюдением врачей терапевтов и психотерапевтов в «Челябинском геронтологическом центре» и имели одинаковые возраст-ассоциированные заболевания. В качестве второй контрольной группы в работу включены условно-здоровые доноры ГБУЗ «Челябинская областная станция переливания крови» – группа «Репродуктивный возраст», 24 человека, средний возраст – 35,2±4,9 года. Исследование выполнено в рамках Соглашения с «Челябинским геронтологическим центром» от 08.02.2015 г., одобрено этическим комитетом Челябинского государственного университета (протокол № 2 от 27.08.2019). Письменное информированное согласие получено от всех участников.

Экспрессию микроРНК: let-7d-5p, let-7g- 5p, miR-21, miR-124-3p, miR-146a-5p, miR-155, miR- 342-3p определяли в лейкоцитах периферической крови. Выделение фракции лейкоцитов проводили центрифугированием цельной крови на 3000 об/мин в течение 10 мин, отбором плазмы с тромбоцитами, сбором кольца лейкоцитов, лизированием эритроцитов с помощью NH₄Cl и последующей отмывкой лейкоцитов в фосфатно-солевом буфере. Общую РНК получали фенол-хлороформным методом с использованием реагента TRIZol (MRC, США). Концентрацию и чистоту выделения РНК анализировали на флуориметре Quatus (Promega, США). кДНК синтезировали из общей РНК с применением набора реагентов «ОТ-1» для обратной транскрипции («Синтол», Москва). ПЦР в реальном времени проводили с использованием набора реагентов для количественной ПЦР с SYBRGreen («Синтол», Москва) на приборе ДТ-прайм («ДНК-диагностика», Москва), каждый образец анализировали в двух повторах. Программа для обратной транскрипции и амплификации была взята из работы Yang и соавт.: ОТ – инкубация при 42 °С в течение 60 мин; амплификация – 1 цикл – 95 °С в течение 3 мин, затем 40 циклов 95 °С – 5 с, 62 °С – 35 с [15]. Были использованы следующие нуклеотидные последовательности праймеров для микроРНК: let- 7d-5p forward 5’-GCGCGAGGAAACCAGGAT-3′, reverse 5’-GCACCACAGGAAGGCTTTTTT-3′; let-7g-5p forward 5’-CAGTAAGAAATATGGTGTGGACCTCA-3′, reverse 5’-GATGTATTTGTTGTCATGCAAGGAC-3′; miR-21 forward 5’-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3′, reverse 5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′; miR-124-3p forward 5’-TAAGGCACGCGGTGAATGCC-3′, reverse 5’-GATTGAATCGAGCACCAGTTAC-3′; miR-146a-5p forward 5’-ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCATG-3′, reverse 5’-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′; miR-155 forward 5’-GCGGTTAATGCTAATCGTGATA-3′, reverse 5’-CGAGGAAGAAGACGGAAGAAT-3′; miR-342-3p forward 5’- TCCTCGCTCTCACA CAGAAATC-3′, reverse 5’-TATGGTTGTTCAC GACTCCTTCAC-3′. В качестве «гена домашнего хозяйства» использовали ген малой ядерной ДНК U6 forward 5’-AACGCTT CACGAATTTGCGT-3′, reverse 5’-CTCGCTT CGGCAGCACA-3′.

Уровень экспрессии микроРНК (у. е.) рассчитывали путем прямого сравнения данных по формуле: R = E ^(C(T)1-^C(T)2) = E ^{Ä С(T)}, где

R – относительная концентрация продукта реакции; E – эффективность ПЦР; ^C(T)1 – номер цикла ПЦР, на котором наблюдается флуоресценция реакционной смеси контрольного гена (U6); ^C(T)2 – номер цикла ПЦР, на котором наблюдается флуоресценция реакционной смеси исследуемого гена (микроРНК).

Все значения экспрессии микроРНК были умножены на 10000.

В ходе статистической обработки данных были рассчитаны медиана и интерквартильный диапазон. Для сравнения выборок применяли метод Краскела–Уоллиса с попарными сравнениями по Коноверу–Инману. Расчеты выполнены программе PAST v. 3.20. Во всех случаях статистически значимыми считались различия и зависимости при p ≤ 0,05.

Результаты и обсуждение

В рамках нашего пилотного обследования лиц пожилого/старческого возраста с сосудистой деменцией, при здоровом старении, лиц репродуктивного возраста, в лейкоцитах периферической крови была проведена оценка уровня экспрессии семи микроРНК, участвующих в воспалении и нейроиммунных функциях (табл. 1).

Различия между группами были характерны только для микроРНК-21, микроРНК-124 и микроРНК-342.

У персон пожилого/старческого возраста, по сравнению с лицами репродуктивного возраста, значимо повышена экспрессия: в группе «Здоровая старость» – микроРНК-21 и микроРНК-342, в группе «Сосудистая деменция» – микроРНК-21, микроРНК-124 и микроРНК-342 (табл. 1).

 

ТАБЛИЦА 1. УРОВНИ ЭКСПРЕССИИ микроРНК В ЛЕЙКОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЛИЦ С НАЛИЧИЕМ /ОТСУТСТВИЕМ СОСУДИСТОЙ ДЕМЕНЦИИ, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 1. MicroRNA EXPRESSION IN PERIPHERAL BLOOD LEUKOCYTES OF PEOPLE WITH/WITHOUT VASCULAR DEMENTIA, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Показатели, у. е. Indicators, c. u.	Репродуктивный возраст Adults (n = 24)	Здоровая старость Healthy ageing (n = 21)	Сосудистая деменция Vascular dementia (n = 9)
let-7d	15,61 (10,84-18,22)	14,80 (11,22-23,23)	19,54 (15,61-24,65)
let-7g	405,32 (334,93-569,91)	441,94 (301,86-525,56)	525,56 (457,53-1134,40)
микроРНК-21 miR-21	0,02 (0,01-0,03)	0,28* (0,01-1,26)	0,45* (0,04-0,65)
микроРНК-124 miR-124	0,32 (0,22-0,40)	0,24 (0,17-0,70)	1,12* ** (0,69-1,40)
микроРНК-146a miR-146a	0,02 (0,003-0,074)	0,004 (0,003-0,011)	0,01 (0,003-0,013)
микроРНК-155 miR-155	0,20 (0,13-0,36)	0,09 (0,024-0,310)	0,19 (0,06-0,34)
микроРНК-342 miR-342	0,003 (0,002-0,007)	0,10* (0,003-0,650)	0,50* ** (0,330-1,500)

Примечание. * – значимые различия между группами «Здоровая старость» / «Деменция» и группой «Репродуктивный возраст» (p ≤ 0,05). ** – значимые различия между группами «Здоровая старость» и «Деменция» (p ≤ 0,05).

Note. *, statistically significant differences between groups of Healthy ageing / Dementia and Adults (p ≤ 0.05); **, statistically significant differences between groups of Healthy ageing and Dementia (p ≤ 0.05).

 

При сравнении персон пожилого/старческого возраста с наличием/отсутствием когнитивных нарушений показано, что у лиц с сосудистой деменцией уровень экспрессии микроРНК-124 и микроРНК-342 в лейкоцитах был значимо выше, чем у персон при здоровой старости (табл. 1).

В настоящее время процессы старения определены как хроническая стрессовая ситуация, сопровождающаяся конверсией функций клеток врожденной иммунной системы от эффекторных к гуморальным – продукции цитокинов, создателей хронического низкоуровневого системного воспаления, выступающих инициаторами развития нейровоспаления, когнитивной недостаточности и нейродегенеративных заболеваний (сосудистая деменция, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и др.) [2]. Для данных патологий характерны общие факторы риска и клинические симптомы, что затрудняет их дифференциальную диагностику, подходы к эффективным методам лечения и инициирует поиски значимых и малоинвазивных биомаркеров указанных патологий.

Большой поток литературы рассматривает в качестве таких биологических маркеров микроРНК – критических модуляторов генной экспрессии практически всех биологических процессов, в том числе иммунных и нервных при старении [14].

Рядом авторов была предпринята попытка сегрегации сосудистой деменции от других форм НЗ на основе циркуляторных микроРНК. Так, в обзоре Blount и соавт. показано, что изменение уровней: микроРНК-17, микроРНК-18а, микроРНК-21 микроРНК-29а, микроРНК-7а, микроРНК-10b и микроРНК-130b в циркуляции ассоциировано с сосудистой деменцией [4]. В то же время Prabhakar и соавт. продемонстрировано, что для идентификации сосудистой деменции от болезни мелких сосудов головного мозга могут быть использованы низкие уровни экспрессии микроРНК-409 и высокие – микроРНК-451а, микроРНК-486 и микроРНК-502 в плазме крови [9]. Без рассмотрения лейкоцитарной сигнатуры микроРНК лимитируется информационная составляющая о ее роли в патогенезе патологических процессов и, следовательно, поиск мишеней для терапии [11]. Поэтому нами был применен другой подход.

Как отмечено нами ранее, что важной составляющей всех НЗ, в том числе и сосудистой деменции, является нейровоспаление, инициатором которого выступает системное хроническое низкоуровневое воспаление. Ранее нами получены аналогичные данные: у персон пожилого/старческого возраста группы «Здоровая старость» были обнаружены значимо высокие концентрации IL- 6, IL- 1β, IFNγ и IL-10, в плазме крови по сравнению с показателями людей репродуктивного возраста. У людей с сосудистой деменцией воспалительный потенциал был выше, достигая значимо повышенных концентрации IL-6 и TNFα на фоне низких уровней IL-1β, по сравнению с персонами группы «Здоровая старость» [1].

Ключевыми регуляторами цитокиновой сети и нейровоспаления, а также инициаторами НЗ выступают некоторые микроРНК. Среди них наиболее изученные провоспалительные: микроРНК-155 и микроРНК-342; противовоспалительные: микроРНК-146а, микроРНК-21, микроРНК-124; и микроРНК, обладающие как про-, так и противовоспалительными свойствами: представители семейство let-7 [7, 13].

Важно отметить, что, по данным авторов, микроРНК-124, микроРНК-146а, микроРНК-155 и ряд дополнительных, в том числе микроРНК-21 и микроРНК-342, не только участвуют в регуляции воспалительных путей, но и определены в качестве посредников между иммунной и нервной системами [4, 8, 14]. Они контролируют обоюдонаправленную коммуникацию, в ходе которой модулируются функции иммунной системы и мозга, в частности при физиологических условиях, его высших функций – пластичность, когнитивные способности, нейрогенез, способность восстанавливаться после ментальных стрессов [5, 14]. Однако такая тесная эволюционная интеграция стала основой развития нейроиммунных копатологий, таких как аутизм, шизофрения, болезнь Альцгеймера, сосудистая деменция и других.

В результате в своем пилотном исследовании мы оценили уровень экспрессии семи представленных выше микроРНК в лейкоцитах периферической крови людей пожилого/старческого возраста с сосудистой деменцией и при здоровом старении. Для характеристики хронического низкоуровневого системного воспаления, ассоциированного со здоровой старостью, в качестве контроля в работу была включена группа персон репродуктивного возраста. Лейкоциты были выбраны нами как клетки крови, отвечающие за иммунные функции, и, прежде всего, продукцию цитокинов при старении. Необходимо отметить, что существуют различия профилей экспрессии микроРНК в лейкоцитах и плазме крови, что можно объяснить фактом наличия в плазме микроРНК, освобождаемой не только клетками крови, но также внеклеточной микроРНК, происходящей из других тканей, в частности, мозга [11].

В результате работы, между исследуемыми группами нами не обнаружено статистически значимых различий в уровнях экспрессии важного активатора провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6 и TNFα) – микроРНК 155. Такой результат может быть связан сильными межиндивидуальными различиями внутри групп, небольшими выборками обследованных лиц или нивелированием различий в связи с перекрытием уровней экспрессии разными типами клеток, входящими в пул лейкоцитов, что требует дальнейшего изучения.

Тем не менее мы продемонстрировали, что у лиц с сосудистой деменцией в лейкоцитах периферической крови регистрируется повышенная экспрессия микроРНК-342, которая обладает не только провоспалительными эффектами, но и играет важную роль в пролиферации, дифференцировке нервных клеток и нейротоксичности [4].

На фоне высокой экспрессии микроРНК-342 при сосудистой деменции нами показаны высокие уровни противовоспалительных, нейроиммунных микроРНК: микроРНК-21 и микроРНК-124, что вероятно, может носить компенсаторный характер. Известно, что микроРНК-21 индуцируется множеством провоспалительных молекул, таких как патоген-ассоциированные и повреждение-ассоциированные молекулярные паттерны; функционально лимитирована при нормальных физиологических условиях, а при патологических транскрибируется до высоких уровней. Как отмечено группой авторов [8], у персон с различными возраст-ассоциированными заболеваниями наблюдаются значимые отклонения в уровнях экспрессии микроРНК-21 по отношению к аналогичным показателям при здоровой старости. МикроРНК-124 – определена как критический модулятор иммунных клеток и органов, включая мононуклеары периферической крови, костный мозг, лимфоидные узлы, тимус, а также нервных и глиальных клеток центральной нервной системы, включая астроциты, микроглию, олигодендроциты. В большинстве случаев микроРНК-124 индуцируется воспалительными иммунными сигналами, но функционирует как негативный регулятор для таких сигналов, формируя негативную петлю обратной связи для поддержания гомеостаза [10].

Заключение

Таким образом, в нашем пилотном исследовании мы показали, что оценка уровней экспрессии микроРНК: микроРНК-124 и микроРНК-342 в лейкоцитах периферической крови может выступать информативным биомаркером для диагностики сосудистой деменции.

Однако работа требует продолжения в нескольких направлениях: в увеличении количества обследованных лиц, расширения сигнатуры рассматриваемых РНК и нейродегенеративных патологий.

About the authors

A. L. Burmistrova

Chelyabinsk State University

Email: julse@rambler.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Department of Microbiology, Immunology and General Biology, Faculty of Biology

Russian Federation, Chelyabinsk

A. S. Alekseeva

Chelyabinsk State University

Email: julse@rambler.ru

Postgraduate Student, Department of Microbiology, Immunology and General biology, Faculty of Biology

Russian Federation, Chelyabinsk

M. E. Cazaux

Chelyabinsk State University

Email: julse@rambler.ru

Postgraduate Student, Department of Microbiology, Immunology and General biology, Faculty of Biology

Russian Federation, Chelyabinsk

Yu. Yu. Filippova

Chelyabinsk State University

Author for correspondence.
Email: julse@rambler.ru

PhD (Biology), Associate Professor, Department of Microbiology, Immunology and General Biology, Faculty of Biology

Russian Federation, Chelyabinsk

References

Supplementary files