Функция Т-лимфоцитов кожи человека в заживлении ран в эксперименте in vitro

Полный текст

Введение

Длительно незаживающие раны – одна из проблем современной медицины. В процессе заживления кожной раны могут возникнуть осложнения, вследствие которых на месте острой раны может возникнуть хроническая рана или чрезмерное рубцевание. Первоначальные представления об иммунологическом надзоре за кожей подчеркивали важность иммунных клеток, которые циркулируют между лимфатическими узлами, дренирующими кожу, периферическими тканями и тканями, которые могут быстро реагировать на проблемы с антигенами [22]. Однако недавно было предложено, что резидентные Т-клетки кожи, а не рекрутированные Т-клетки, играют главную роль в кожном иммунном гомеостазе и патологии [23]. Так, резидентные Т-клетки памяти кожи стратегически позиционируются как первая линия защиты от вторичной антигенной стимуляции [21] Т-клетки, которые экспрессируют гетеродимеры, состоящие из γ- и δ-цепей рецептора Т-клеток (TCR) обнаруживаются как в эпидермисе, так и в дерме кожи человека и животных [8]. Пул Т-клеток в эпидермисе мыши состоит исключительно из γδ⁺T-клеток с инвариантными TCR, обозначенными как дендритные эпидермальные T-клетки (DETC). В отличие от грызунов в эпидермисе человека существует также большая популяция эпидермальных αβ⁺T-клеток [17]. Помимо анализа их присутствия, мало что известно об этих популяциях Т-клеток кожи человека. Исследование пула Т-лимфоцитов кожи человека и их функциональной активности позволит получить представление о патогенезе острых ран и хронических ран.

Цель данной работы – изучить роль T-лимфоцитов кожи в заживлении острых и хроническими ран человека in vitro.

Материалы и методы

Образцы нормальной кожи человека (n = 20 (19 женщин и 1 мужчины)) возраст 56,8±8,2 года были получены в результате блефаропластики. Образцы кожи пациентов (n = 10), перенесших недавнюю травму, были использованы для изучения острых ран. Ни один из пациентов не имел системного заболевания или не получал иммунодепрессивного лечения. Образцы ткани пациентов (n = 9) с хроническими ранами, которые не зажили в течение 2 месяцев, использовали для изучения хронических ран. Образцы ткани и периферической крови для исследования были доставлены из ГБУЗ ТО «Областная клиническая больница № 1» (отделение пластической и гнойной хирургии). Венозную кровь от 20 здоровых доноров получали путем пункции периферической вены и собрали в вакуумную пробирку с добавлением К₃ЭДТА. Все исследования выполнены с информированного согласия испытуемых и в соответствии с «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. В качестве источника клеток кожи использовали биоптаты кожи, полученные по раннее описанной методике [1]. Исследование фенотипического состава Т-лимфоцитов кожи проводили методом проточной цитометрии с использованием прямой иммунофлуоресценции на приборе Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США) с применением программного обеспечения CXP 2.0. Настройку проточного цитофлуориметра проводили с учетом рекомендаций Хайдукова и соавт. [4]. Для анализа использовали антитела к IGF-1 (G-17) и сопутствующие блокирующие пептиды (Santa Cruz Biotechnology (США)). Моноклональные антитела CD3, CD69, TCRαβ и TCRγδ, меченные флуоресцирующими красителями (Beckman Coulter, США). В качестве негативного контроля использовались IgG (Beckman Coulter). Анализируемые клетки кожи в виде осадка ресуспендировали в 50 мкл PBS. После добавления антител образцы 20 минут инкубировали в холодильнике при t +4 °С и отмывали от не связавшихся антител методом центрифугирования в течение 7 минут при 600 g PBS. Для каждого из образцов анализировали не менее 50000-75000 клеток. Удаление эритроцитов из образцов крови проводили по безотмывочной технологии с использованием лизирующего раствора Versa Lyze (Beckman Coulter, США).

Для изучения способности резидентными эпидермальными Т-клетками спонтанной продукции инсулиноподобного фактор роста (IGF- 1), IL-2, IL-22, IL-17 и при стимуляции in vitro резидентные Т-клетки выделяли из нормальной кожи и оценивали секрецию биологически активных веществ с помощью проточной цитометрии. Суспензию клеток кожи получали по раннее описанной методике [1], инкубировали с Брефелдином А в течение 24 часов в присутствии или в отсутствие с ФГА (при конечной концентрации вещества – 100 нг/мкл) и иономицина кальция (при конечной концентрации вещества – 1 мкг/ мкл). После окончания культивирования обе клеточные культуры дважды отмывали PBS, инкубировали с моноклональными антителами, в течение 20 минут при t +4 °С в темноте отмывали от несвязавшихся антител методом центрифугирования в течение 7 минут при 600 g PBS.

Статистическую обработку проводили при помощи программного обеспечения Statistika 8.0 (StatSoft, США). Данные были проанализированы с использованием непарного t-критерия Стьюдента для определения значимых различий между двумя группами пациентов и парного t-критерия для определения значимых различий в одной и той же группе. Все результаты были признаны значимыми при p ≤ 0,05.

Результаты

Ранее нами было установлено, что процессы апоптоза и пролиферации играют важную роль как в патогенезе образования рубцовой ткани, так и в поддержании гомеостаза здоровой кожи [2, 3, 5]. Прежде чем исследовать роль резидентных T-клеток в заживлении ран и гомеостазе, мы определили наличие популяций T-лимфоцитов в здоровой коже человека [7]. Т-лимфоциты кожи сравнивали с периферическими Т-лимфоцитами крови здоровых доноров. Мы обнаружили значительное количество γδ⁺T-клеток (15,9%±2,7 и 3,4±0,9 соответственно) в коже по сравнению с кровью. Субпопуляция αβ⁺T-клеток составила 0,9%±0,03 и 69,9%±18,6 соответственно. Мы не обнаружили достоверных различий в соотношении субпопуляций CD3⁺αβ⁺ и CD3⁺γδ⁺ при острых и хронических незаживающих ранах и здоровым эпителием. Мы предположили, что незаживление ран и хронизация вызваны нарушением функциональной активности αβ⁺ и/или γδ⁺Т-лимфоцитов. В нашем исследовании относительное количество Т-клеток, экспрессирующих на своей поверхности CD69, полученных от пациентов с острой раны, достоверно увеличивалось по сравнению с нормальным эпидермисом и хронической раной (10,5%±2,3 и 7,6%±1,24 и 3,0%±1,05 соответственно (р < 0,001)). Количество клеток с фенотипом CD3⁺αβ⁺CD69⁺ достоверно не отличалось у всех трех групп сравнения.

Чтобы исследовать способность Т-лимфоцитов кожи участвовать в заживлении раны, мы оценили продукцию IGF-1 клетками здоровой кожи с помощью проточной цитометрии. Обнаружено, что эпидермальные T-лимфоциты спонтанно (in vitro) продуцируют IGF-1 на низких уровнях CD3⁺αβ⁺ (3,9±1,3%) и CD3⁺γδ⁺ (1,9±0,6 %), как и описано для DETC мыши [17]. Продукция IGF-1 кожными резидентными Т-клетками, окрашенными анти-IGF-1, увеличивается при стимуляции ФГА (100 нг/ мкл) и иономицином кальция (1 мкг/ мкл) в пуле CD3⁺αβ⁺ до 10,8±2,1% (p < 0,001), а в субпопуляции CD3⁺γδ⁺ до 7,3±1,9%; (p < 0,001) относительно базального уровня.

Резидентные Т-клетки кожи реагируют на ее повреждение, инфицирование, стресс секрецией цитокинов и факторов роста, которые стимулируют клеточную пролиферацию, вызывают цитолиз и активируют другие клетки для инфильтрации пораженной области.

По данным нашего исследования, резидентные T-лимфоциты, выделенные из незаживающих хронических кожных ран, не секретируют IGF-1 по сравнению с T-клетками, выделенными из острых ран и здоровой кожи (табл. 1).

 

ТАБЛИЦА 1. ПРОДУКЦИЯ IGF-1 Т-КЛЕТКАМИ ПРИ ОСТРЫХ И ХРОНИЧЕСКИХ РАНАХ

TABLE 1. PRODUCTION OF IGF-1 BY T CELLS IN ACUTE AND CHRONIC WOUNDS

Резидентные Т-лимфоциты Resident T lymphocytes	Здоровая кожа Healthy skin (n = 20)	Острая рана Acute wound (n = 10)	Хроническая рана Chronic wound (n = 9)	р
CD3+αβ+ (%)	3,9±1,3	13,6±5,6#*	1,7±0,9	# *p < 0,001
CD3+γδ+ (%)	1,9±0,6	8,9±3,1#*	0,44±0,02	# *p < 0,001

Примечание. ^# – разница со здоровой кожей; * – разница с хронической раной.

Note. ^#, difference with healthy skin; *, difference with chronic wound.

 

Одним из признаков ранней стадии заживления раны является увеличение IGF-1 в месте раны, было показано, что уровни IGF-1 снижаются в незаживающих ранах от пациентов с диабетом [14]. Поэтому мы выдвинули гипотезу, что резидентные Т-клетки кожи активируются при повреждении in vivo с образованием IGF- 1. Так, уровни IGF-1, продуцируемые как αβ⁺ (25,7%±5,1 и 10,8%±2,1 соответственно), так и γδ⁺Т-клетки (19,2%±3,7 и 7,3%±1,9 соответственно), стимулированные ФГА и иономицином, полученными из биоптата острой раны, были выше уровня инсулиноподобного фактора роста 1 в Т-клетках здоровой кожи. T-лимфоциты, выделенные из незаживающих хронических ран, практически не отвечали на стимуляцию митогенами CD3⁺αβ⁺ (1,7±0,9 спонтанная и 2,3±0,2 стимулированная секреция), CD3⁺γδ⁺ (0,44±0,02 и 3,1±1,4 соответственно). Чтобы определить, является ли это уникальным ответом резидентных T-клеток кожи во время повреждения, αβ⁺ и γδ⁺T-клетки были выделены из крови как здоровых доноров, так и от пациентов с острыми и хроническими ранами. Спонтанные уровни Т-клеток, продуцирующие IGF-1, выделенные у пациентов с ранами и здоровых доноров, статистически недостоверно отличались. Базальный уровень IGF-1, секретируемый субпопуляцией резидентных CD3⁺αβ⁺ клеток в исследуемых группах, составил: хроническая незаживающая рана (3,5%±0,9); острая рана (7,2%±2,8) и здоровая кожа (5,0%±1,6) (р = 0,12)) и пулом CD3⁺γδ⁺ лимфоцитов (2,9%±1,0; 6,7%±3,1 и 3,3%±0,8 соответственно (р = 0,11)). При стимуляции in vitro митогенами секреция IGF-1 тремя пулами Т-лимфоцитов крови достоверно значимо увеличивались (р < 0,001). Возможно, повышенная продукция αβ⁺γδ⁺Т-лимфоцитами IGF-1 во время заживления раны ограничена локальной средой. В совокупности наши результаты демонстрируют, что Т-клетки кожи человека являются локальным источником IGF-1, обладая способностью усиливать экспрессию фактора роста при активации, влияя на процессы регенерации раны.

Далее мы исследовали способность γδ⁺T-лимфоцитов здоровой и поврежденной кожи синтезировать цитокины. Чтобы проанализировать функцию CD69 в секреции IL-22, IL-2 и IL- 17 дермальными γδ⁺Т-клетками in vitro, мы приготовили суспензии клеток кожи [1], полученных от трех исследуемых групп. Анализ методом проточной цитометрии показал более низкую спонтанную секрецию IL-22 в CD69-дефицитных дермальных γδ⁺Т-клетках по сравнению с клетками, полученными из острой раны и здоровой кожи (4,56%±2,3 и 23,9%±1,05 и 10,6%±1,24 соответственно (р < 0,001)). Резидентные Т-лимфоциты, полученные из хронической раны, не ответили на стимуляцию in vitro ФГА и иономицином кальция в течение 24 часов в отличие от групп сравнения (5,6%±2,3 и 55,4%±1,05 и 21,8%±1,24 соответственно (р < 0,001)). CD3⁺γδ⁺ клетки, выделенные из хронических ран, продуцируют значительно меньше IL-2 после стимуляции по сравнению с клетками, выделенными из острой раны и нормального эпидермиса до (0,9%±0,08 и 22,6%±2,5 и 3,9%±1,0 соответственно (р < 0,01)) и после стимуляции митогеном (1,8%±0,5 и 48,6%±8,0 и 9,9%±3,5 соответственно (р < 0,001)). При анализе количества резидентных γδ⁺Т-лимфоцитов кожи, секретирующих IL-17, мы получили следующие цифры: здоровая кожа (1,4%±0,085), острая рана (11,3%±3,2) хроническая рана (31,7%±11,8) (р < 0,001)).

Обсуждение

Кожа человека содержит эпидермальные резидентные αβ⁺ и γδ⁺Т-клетки, которые могут функционировать при иммунном надзоре за кожей [10]. Ранее нами было установлено, что процессы апоптоза и пролиферации играют важную роль как в патогенезе образования рубцовой ткани, так и в поддержании гомеостаза здоровой кожи [2, 3, 4]. Прежде чем исследовать роль резидентных T-клеток в заживлении ран и гомеостазе, мы определили наличие популяций T-лимфоцитов в здоровой коже человека [5]. Т-лимфоциты кожи сравнивали с периферическими Т-лимфоцитами крови здоровых доноров. Мы обнаружили значительное количество γδ⁺T-клеток в коже по сравнению с кровью (р < 0,001). Основной пул αβ⁺T-клеток был обнаружен в крови здоровых доноров (р < 0,001). Соответственно, γδ⁺Т-лимфоциты являются популяцией кожи. Мы не обнаружили достоверных различий в соотношении субпопуляций CD3⁺αβ⁺ и CD3⁺γδ⁺ при острых и хронических незаживающих ранах и здоровым эпителием [10]. Значит, незаживление ран и переход в хроническую форму может быть вызван нарушением функциональной активности резидентных Т-лимфоцитов. Исследования Cibrián D. et al. показали, что экспрессия CD69 на тканевых резидентных иммунных клетках при воспалении является маркером различных сигнальных путей, которые потенциально регулируют регенерацию тканей [9]. В нашем исследовании относительное количество Т-клеток, экспрессирующих на своей поверхности CD69, полученных от пациентов с острой раны, достоверно увеличивалось по сравнению с нормальным эпидермисом и хронической раной (р < 0,001). Количество клеток с фенотипом CD3⁺αβ⁺CD69⁺ достоверно не отличалось у всех трех групп сравнения. По результатам этого этапа исследования можно сделать предварительный вывод, что резидентные γδ⁺Т-лимфоциты в хронических ранах имеют функциональные нарушения и не способны продуцировать биологически активные вещества во время процесса восстановления тканей. По данным литературного анализа, мышиные DETC регулируют гомеостаз кожи посредством секреции IGF-1, члена семейства инсулиновых гормонов роста. IGF-1 используется кератиноцитами в коже для развития и поддержания эпидермиса [17]. В коже человека IGF-1 регулирует форму и миграцию кератиноцитов для обеспечения эпителизации раны [24]. Предполагается, что фибробласты являются основным источником IGF-1 в коже [13]. Чтобы исследовать способность Т-лимфоцитов кожи участвовать в заживлении раны, мы оценили продукцию IGF- 1 клетками здоровой кожи с помощью проточной цитометрии. Обнаружено, что эпидермальные T-лимфоциты, как αβ⁺, так и γδ⁺ спонтанно (in vitro) продуцируют IGF-1 на низких уровнях, что описано и для DETC мыши [17]. Продукции IGF-1 кожными резидентными Т-клетками окрашенными анти-IGF-1 увеличивается при стимуляции митогенами в пуле CD3⁺αβ⁺ и CD3⁺γδ⁺ (p < 0,001) относительно базального уровня.

Резидентные Т-клетки кожи реагируют на ее повреждение, инфицирование, стресс секрецией цитокинов и факторов роста, которые стимулируют клеточную пролиферацию, вызывают цитолиз и активируют другие клетки для инфильтрации пораженной области. Предыдущие исследования показали, что количество IGF-1 в раневой жидкости человека достигает максимальных значений в течение 24 часов после повреждения [12]. Уровень IGF-1 увеличивается после повреждения эпидермиса кожи, достигая максимума через 3 дня после ранения [20]. По данным нашего исследования, резидентные T-лимфоциты, выделенные из незаживающих хронических кожных ран, не секретируют IGF-1, по сравнению с T-клетками, выделенными из острых ран и здоровой кожи (p < 0,001) (табл. 1).

Одним из признаков ранней стадии заживления раны является увеличение IGF-1 в месте раны, было показано, что уровни IGF-1 снижаются в незаживающих ранах от пациентов с диабетом [13]. Поэтому мы выдвинули гипотезу, что резидентные Т-клетки кожи активируются при повреждении in vivo с образованием IGF-1. Т-лимфоциты, полученные из биоптата острой раны, при стимуляции секретируют достоверно большее количество IGF-1 (p < 0,001), чем Т-клетки здоровой кожи. T-лимфоциты, выделенные из незаживающих хронических ран, не отвечали на стимуляцию митогенами. Чтобы определить, является ли это уникальным ответом резидентных T-клеток кожи во время повреждения, αβ⁺ и γδ⁺T-клетки были выделены из крови доноров и пациентов. При стимуляции in vitro митогенами секреция IGF-1 тремя пулами Т-лимфоцитов крови достоверно значимо увеличивались (р < 0,001). Возможно, повышенная продукция αβ⁺ γδ⁺Т-лимфоцитами IGF-1 во время заживления раны ограничена локальной средой. В совокупности наши результаты демонстрируют, что Т-клетки кожи человека являются локальным источником IGF-1, обладая способностью усиливать экспрессию фактора роста при активации, влияя на процессы регенерации раны.

Далее мы исследовали способность CD3⁺γδ⁺T-лимфоцитов здоровой и поврежденной кожи синтезировать цитокины. Известно, что CD69 регулирует секрецию CD8 T-клетками и γδT-клетками IFNγ, IL-17 и IL-22, обусловливая иммунный ответ типа 3 (GATA 3) [9]. Так, IL-22 увеличивает пролиферацию и миграцию кератиноцитов, стимулирует выработку коллагена дермальными фибробластами и способствует дифференцировке миофибробластов после ранения [19]. Анализ методом проточной цитометрии показал более низкую спонтанную секрецию IL- 22 и IL-2 в CD69-дефицитных дермальных γδ⁺Т-клетках по сравнению с клетками, полученными из острой раны и здоровой кожи (р < 0,001). Резидентные Т-лимфоциты, полученные из хронической раны, не ответили на стимуляцию митогенами in vitro в течение 24 часов в отличие от групп сравнения (р < 0,001). Можно предположить, что резидентные Т-лимфоциты в хронической раневой среде становятся менее чувствительными к активации. Потеря функции γδ⁺Т-клеток приводит к длительному заживлению ран у мышей с диабетом [21]. При анализе количества резидентных γδ⁺Т-лимфоцитов кожи, секретирующих IL-17 мы получили следующие цифры: здоровая кожа (1,4%±0,085), острая рана (11,3%±3,2) хроническая рана (31,7%±11,8) (р < 0,001)). Умеренная продукция IL-17 резидентными Т-лимфоцитами оказывает благоприятное действие в заживлении острых ран, способствуя пролиферации кератиноцитов и выработке противомикробных пептидов [15], нерегулируемая же передача сигналов семейства IL-17 может приводить к длительному воспалению. Возможно, постоянно повышенный уровень IL-17 связан с хроническим незаживающим течением раневого процесса. Ранее проведенные исследования показали, что уровни семейства IL-17 в раневой жидкости из венозных язв повышены по сравнению с уровнями венозной крови пациентов, взятых в одно и то же время, и семейство IL-17 также повышено в образцах пораженной ткани у пациентов с гангренозной пиодермией относительно нормальной кожи [16, 18]. Однако ни в одном из исследований не изучались конкретные подтипы семейства IL- 17. Проведенное исследование указывает на то, что резидентные Т-клетки, хотя и присутствуют в хронических ранах, функционально нарушены и не способны продуцировать IGF-1 и цитокины в процессе восстановления тканей.

Заключение

Заживление кожной раны представляет собой сложный процесс, требующий постоянной связи между клетками в форме высвобождения цитокинов, межклеточных контактов и межклеточных взаимодействий. Данное исследование демонстрирует, что попадающие в кожу популяции резидентных Т-клеток (αβTCR⁺ и γδTCR⁺) способны секретировать IGF-1, IL-2, IL-22, IL-17, нормализовать гомеостаз кожи и способствовать заживлению ран. Хронические раны характеризуются стойким воспалением с замедленным заживлением. Поскольку резидентные Т-лимфоциты обеих исследуемых субпопуляций (CD3⁺αβ и CD3⁺γδ⁺ в хронических незаживающих ранах имеют функциональные нарушения и не способны продуцировать биологически активные вещества во время процесса регенерации и ремоделирования тканей. Возможно, активирующие антигены чрезмерно стимулируют резидентные Т-клетки в хронической ране, что приводит к их невосприимчивости к активационным сигналам. Дисфункция резидентных Т-лимфоцитов может быть вызвана повышенной экспрессией ингибирующих рецепторов, таких как апоптоз усиливающаяся в ответ на тяжелые повреждения. Полученные результаты показывают роль резидентных Т-клеток, находящихся в коже человека, в заживлении ран и дают новое представление о понимании патогенеза хронических ран. С клинической точки зрения исследование повреждения резидентных Т-клеток на ранней стадии процесса заживления раны может быть прогностическим фактором для формирования хронической раны.

Об авторах

Елена Геннадьеавна Костоломова

ФГБОУ ВО «Тюменский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ; ООО «Тюменский филиал института фундаментальной и клинической иммунологии»

Автор, ответственный за переписку.
Email: lenakost@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0237-5522

к.б.н., доцент кафедры микробиологии, научный сотрудник лаборатории геномики, протеомики и метаболомики Университетского НИИ медицинских биотехнологий и биомедицины ФГБОУ ВО «Тюменский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ; заведующая научно-исследовательской лабораторией ООО «Тюменский филиал института фундаментальной и клинической иммунологии», г. Тюмень, Россия

Россия, г. Тюмень; г. Тюмень

Святослав Александрович Стрелин

«Ай Кью Пластик» Тимура Хайдарова

Email: svyatos@mail.ru

к.м.н., доцент, врач, пластический хирург «Ай Кью Пластик» Тимура Хайдарова, Москва, Россия

Россия, Москва

Юрий Геннадьевич Суховей

ООО «Тюменский филиал института фундаментальной и клинической иммунологии»; ФГБУН «Федеральный исследовательский центр “Тюменский научный центр” Сибирского отделения Российской академии наук»

Email: i_yura62@mail.ru

д.м.н., профессор, ФГБУН «Федеральный исследовательский центр “Тюменский научный центр” Сибирского отделения Российской академии наук»; ведущий научный сотрудник ООО «Тюменский филиал института фундаментальной и клинической иммунологии», г. Тюмень, Россия

Россия, г. Тюмень; г. Тюмень

Ирина Генриховна Унгер

ООО «Тюменский филиал института фундаментальной и клинической иммунологии»

Email: irinaunger@yandex.ru

к.м.н., директор, ведущий научный сотрудник ООО «Тюменский филиал института фундаментальной и клинической иммунологии», г. Тюмень, Россия

Россия, г. Тюмень

Татьяна Владимировна Акунеева

ООО «Тюменский филиал института фундаментальной и клинической иммунологии»

Email: tatyana_akuneeva@mail.ru

старший научный сотрудник ООО «Тюменский филиал института фундаментальной и клинической иммунологии», г. Тюмень, Россия

Россия, г. Тюмень

Александр Анатольевич Марков

ФГБОУ ВО «Тюменский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Email: alexdoktor@inbox.ru

к.м.н., директор, ведущий научный сотрудник Университетского НИИ медицинских биотехнологий и биомедицины, доцент кафедры медицинской профилактики и реабилитации ФГБОУ ВО «Тюменский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, г. Тюмень, Россия

Россия, г. Тюмень

Елизавата Дмитриевна Полянских

ФГБОУ ВО «Тюменский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Email: polyanskih.li@mail.ru

студентка Института материнства и детства ФГБОУ ВО «Тюменский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, г. Тюмень, Россия

Россия, г. Тюмень

Список литературы

Дополнительные файлы