Иммунобиология лимфотоксина: роль в мышиной модели рассеянного склероза

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Сложность иммунобиологии лимфотоксина (LTα) связана с несколькими модальностями передачи сигнала – от растворимого гомотримера или от мембранного гетеротримера, с участием минимум трех рецепторов. Известно, что лимфотоксин критически важен для образования и поддержания нормальной архитектуры вторичных лимфоидных органов. Несмотря на эти гомеостатические функции LTα, его избыточная продукция характерна для таких аутоиммунных заболеваний, как ревматоидный артрит и рассеянный склероз. Роль лимфотоксина в развитии модели рассеянного склероза у мышей, экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (ЕАЕ), считалась патогенной, так как в ранних работах мыши с генетической инактивацией LTα были резистентны к индукции ЕАЕ. Однако индукция ЕАЕ у RAG1-дефицитных мышей, которым был осуществлен адоптивный перенос костного мозга от LTα-дефицитных мышей, приводила к развитию клинических симптомов ЕАЕ, тем самым ставя под сомнение вывод о роли LTα в развитии ЕАЕ.

Целью работы было прояснение роли LTα в ЕАЕ, вызываемого иммунизацией MOG35-55-пептидом. Для этого использовали мышей с генетическим дефицитом по LTα или по LTβR, являющимся рецептором для мембранного комплекса. Нокаутные по LTα мыши были созданы в лаборатории ранее и свободны от артефакта, связанного с дизайном генетической конструкции, который приводил к подавлению экспрессии гена TNF в миелоидных клетках у широко распространенного «классического» нокаута по LTα.

Оказалось, что мыши с дефицитом LTα и с интактной экспрессией TNF развивали ЕАЕ, сравнимый по клиническим показателям с мышами дикого типа. В то же время генетическая инактивация LTβR приводила к задержке в развитии ЕАЕ, однако на поздних этапах заболевания результатом удаления LTβR было ухудшение клинических симптомов ЕАЕ.

Таким образом, вклад LTα в развитие ЕАЕ является более сложным, чем предполагали ранее, а LTβR выполняет различные функции в зависимости от стадии заболевания – патогенную на ранней стадии и защитную на поздних этапах развития болезни.

Полный текст

Введение

Термин «лимфотоксин» появился примерно в 1968 г. благодаря экспериментам в американских лабораториях G. Granger [6] и B. Waxman [10] в США. В обоих случаях речь шла о цитотоксической активности по отношению к культуре фибробластов, которую высвобождали активированные лимфоциты. После очистки цитотоксического белка из супернатантов лимфобластоидной линии [1] и молекулярного клонирования [7] лимфотоксином стали называть TNF-подобный цитокин (сгоряча, но временно переименованный в TNFβ).

Следующая глава в увлекательной истории о лимфотоксинах была написана в 1993-1994 гг. когда, во-первых, были созданы первые мыши с генетическим нокаутом LTα (бывший TNFβ), фенотип которых оказался сенсационным – у них отсутствовали лимфатические узлы и Пейеровы бляшки [4], во-вторых, был открыт партнер LTα – LTβ, образующий мембранный гетеротримерный комплекс с LTα [2], в-третьих, был охарактеризован новый рецептор, LTβR [3], который и передавал сигнал от мембранного лимфотоксина. При этом LTα действительно может существовать и в TNF-подобной конфигурации гомотримера, и сигналить через TNFR1. Отметим, что позднее в «классическом» LTα-нокауте был обнаружен «встроенный артефакт», связанный с нарушением экспрессии соседнего гена TNF по меньшей мере в миелоидных клетках из-за неоптимального дизайна таргетирующей генетической конструкции [8].

Функции лимфотоксина были изучены в различных экспериментальных моделях заболеваний, в том числе в экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (ЕАЕ), признанной мышиной модели рассеянного склероза. Ранее в работе [12] сообщалось об устойчивости LTα-, но не LTβ-дефицитных мышей к ЕАЕ, что указывало на патогенную роль лимфотоксина, предположительно в виде растворимого LTα. Этот результат как будто подтверждал вывод ранней работы из той же лаборатории [11], в которой использовались блокирующие моноклональные антитела.

В настоящей работе проведенные эксперименты с EAE на LTβR-дефицитных мышах [5] и на LTα-нокаутах, созданных с помощью Сге-loxP технологии [8], привели к новым результатам и выводам.

Материалы и методы

Мыши

В работе использовали мышей на генетической основе C57BL/6с полной инактивацией генов LTα [8] или LTbR [5]. В качестве контроля использовали мышей дикого типа C57BL/6. В экспериментах были использованы самки и самцы возраста 9-12 недель. Мышей разводили и содержали в стандартных условиях Питомника лабораторных животных ФИБХ РАН (Уникальная научная установка «Био-модель» ИБХ РАН; Биоресурсная коллекция «Коллекция лабораторных грызунов SPF статуса для фундаментальных, биомедицинских и фармакологических исследований»), имеющего международную аккредитацию AAALACi. Эксперименты на генетически-модифицированных мышах в модели ЕАЕ были одобрены Биоэтическим комитетом ИМБ РАН (Протокол № 3 от 27.10.2023) и проведены в Автономном экспериментально-биологическом комплексе для временного размещения и исследования генетически модифицированных линий лабораторных мышей категории SPF при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Соглашение № 075-15-2019-1660).

MOG35-55-индуцированный EAE

Индукцию ЕАЕ осуществляли подкожной иммунизацией 100 мкг MOG35-55-пептида (Anaspec, США) в смеси с полным адъювантом Фрейнда (Sigma-Aldrich, США), с добавлением 5 мг/ мл Mycobacterium tuberculosis (BD Difcо, США) и последующим двукратными введением 200 нг Pertussis toxin (Sigma-Aldrich, США). Оценку клинических симптомов проводили ежедневно по стандартной шкале, где 0 – отсутствие симптомов заболевания; 1 – полная потеря тонуса хвоста; 2 – полное нарушение рефлекса переворачивания; 2,5 – нарушение походки и хромота; 3 – частичный паралич задних конечностей; 3,5 – полный паралич задних конечностей; 4 – частичный паралич передних конечностей; 4,5 – полный паралич передних конечностей; 5 – полная потеря двигательной активности.

Статистический анализ

Анализ результатов и статистическую обработку проводили в программе GraphPad Prism с помощью one-way ANOVA.

Результаты и обсуждение

Для изучения роли лимфотоксина в развитии ЕАЕ использовали мышей с удалением LTα или LTbR. Таких мышей подкожно иммунизировали MOG35-55-пептидом в полном адъюванте Фрейнда. Мы обнаружили, что мыши с удалением LTα, полученные в нашей лаборатории [8], восприимчивы к индукции ЕАЕ (рис. 1А) и развивают заболевание, схожее по динамике с заболеванием мышей дикого типа (рис. 1Б, В). Эти результаты не согласуются с опубликованными данными, в которых мыши с конвенциональным удалением LTα были практически полностью резистентны к индукции ЕАЕ [12]. Разногласие фенотипов может объясняться тем, что у мышей с конвенциональным удалением LTα [4] наблюдались дефекты в продукции TNF миелоидными клетками за счет присутствия в генетической конструкции кассеты, ответственной за устойчивость к неомицину [8], которая располагалась на регуляторном участке в предпромоторной области соседнего гена TNF. В действительности LTα-дефицитные LTα∆/∆ мыши (с интактной экспрессией TNF) развивают MOG-зависимый ЕАЕ.

 

Рисунок 1. Двойственная роль LTβR в развитии ЕАЕ: патогенная функция на ранней стадии EAE и защитная функция на поздних стадиях заболевания

Примечание. А – развитие клинических симптомов EAE у мышей дикого типа (C57BL/6) (n = 36), мышей с удалением LTa (n = 34) или LTbR (n = 34), иммунизированных MOG35-55-пептидом в полном адъюванте Фрейнда. Результаты представлены как среднее значение оценки клинических симптомов ± SEM. Б – день развития клинических симптомов EAE. Каждая точка представляет собой индивидуальное значение ± SEM. В – площадь под кривой (area under the curve, AUC), рассчитанная для (А). ns – недостоверные отличия, ** – p < 0,01, *** – p < 0,001, **** – p < 0,0001 (one-way ANOVA).

Figure 1. Dual role of LTβR in EAE development: pathogenic at EAE onset and protective at the late stage of the disease

Note. A, EAE disease course in wild-type (C57BL/6) mice (n = 36), mice with LTα (n = 34) or LTβR (n = 34) deletion immunized with MOG35-55-peptide in complete Freund's adjuvant. Data are shown as mean ± SEM. B, Day of onset of the disease. Each point represents an individual value ± SEM. C, Area under the curve (AUC) calculated for (A). ns, non-significant differences; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001 (one-way ANOVA).

 

 

Интересно, что у мышей, дефицитных по LTbR, наблюдался фенотип, отличный от LTα∆/∆ мышей (рис. 1А), хотя у обеих линий мышей была нарушена передача сигнала от мембранного комлекса лимфотоксина через LTβR. Так, LTbR-/- мыши развивали клинические симптомы ЕАЕ на 14- 15 дни после иммунизации (рис. 1Б), что может свидетельствовать о патогенной роли сигналов от LTβR на ранних этапах заболевания. В то же время удаление LTβR приводило к усилению тяжести клинических симптомов на поздних стадиях EAE по сравнению с мышами дикого типа и с мышами с делецией LTα (рис. 1В). Развитие хронического заболевания при удалении LTbR коррелировало с динамикой симптомов ЕАЕ у мышей, дефицитных по LIGHT, другому лиганду LTβR [9]. Возможно, активация именно сигнального пути LIGHT/LTβR на поздних стадиях заболевания защищает мышей от ухудшения клинических симптомов.

Заключение

В настоящей работе показано, что LTα-дефицитные мыши с интактной экспрессией TNF восприимчивы к индукции MOG35-55-зависимого EAE, что опровергает результаты работы [12]. Вывод другой ранней работы [11] объясняется тем, что использованные антитела TN3.12-19 блокируют только TNF (но не LTα3) мыши.

LTβR может выполнять различные функции в зависимости от стадии ЕАЕ – патогенную на ранних этапах и протективную на поздних этапах EAE. Протективная функция LTβR может быть результатом взаимодействии с лигандом LIGHT, который необходим на стадии ремиелинизации.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант №19-75-30032) и Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках Федеральная научно-техническая программа развития генетических технологий на 2019-2027 годы (Соглашение № 075-15-2021-1067).

Авторы благодарят А.А. Круглова и Д.В. Купраша за содействие в работе.

×

Об авторах

В. С. Гоголева

ФГБУН «Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта» Российской академии наук

Email: violettegogoleva@mail.ru

младший научный сотрудник Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ФГБУН «Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта» Российской академии наук

Россия, Москва

М. С. Друцкая

ФГБУН «Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта» Российской академии наук; Научно-технологический университет «Сириус»

Email: marinadru@gmail.com

д.б.н., ведущий научный сотрудник Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ФГБУН «Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта» Российской академии наук, Москва; доцент, Научно-технологический университет «Сириус»

Россия, Москва; Федеральная территория «Сириус», Краснодарский край

Сергей Артурович Недоспасов

ФГБУН «Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта» Российской академии наук; Научно-технологический университет «Сириус»

Автор, ответственный за переписку.
Email: sergei.nedospasov@gmail.com

д.б.н., профессор, академик РАН, заведующий лабораторией молекулярных механизмов иммунитета ФГБУН «Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта» Российской академии наук, Москва; руководитель направления «Иммунобиология и биомедицина» в Научно-технологическом университете «Сириус»

Россия, Москва; Федеральная территория «Сириус», Краснодарский край

Список литературы

  1. Aggarwal B.B., Moffat B., Harkins R.N. Human lymphotoxin. Production by a lymphoblastoid cell line, purification, and initial characterization. J. Biol. Chem., 1984, Vol. 259, no. 1, pp. 686-691.
  2. Browning J.L., Ngam-ek A., Lawton P., deMarinis J., Tizard R., Chow E.P., Hession C., O’Brine-Greco B., Foley S.F., Ware C.F. Lymphotoxin beta, a novel member of the TNF family that forms a heteromeric complex with lymphotoxin on the cell surface. Cell, 1993, Vol. 72, no. 6, pp. 847-856.
  3. Crowe P.D., VanArsdale T.L., Walter B.N., Ware C.F., Hession C., Ehrenfels B., Browning J.L., Din W.S., Goodwin R.G., Smith C.A. A lymphotoxin-beta-specific receptor. Science, 1994, Vol. 264, no. 5159, pp. 707-710.
  4. de Togni P., Goellner J., Ruddle N.H., Streeter P.R., Fick A., Mariathasan S., Smith S.C., Carlson R., Shornick L.P., Strauss-Schoenberger J., Russell J.H., Karr R., Chaplin D.D. Abnormal development of peripheral lymphoid organs in mice deficient in lymphotoxin. Science, 1994, Vol. 264, no. 5159, pp. 703-707.
  5. Futterer A., Mink K., Luz A., Kosco-Vilbois M.H., Pfeffer K. The lymphotoxin beta receptor controls organogenesis and affinity maturation in peripheral lymphoid tissues. Immunity, 1998, Vol. 9, no. 1, pp. 59-70.
  6. Granger G.A., Williams T.W. Lymphocyte cytotoxicity in vitro: activation and release of a cytotoxic factor. Nature, 1968, Vol. 218, no. 5148, pp. 1253-1254.
  7. Gray P.W., Aggarwal B.B., Benton C.V., Bringman T.S., Henzel W.J., Jarrett J.A., Leung D.W., Moffat B., Ng P., Svedersky L.P. Cloning and expression of cDNA for human lymphotoxin, a lymphokine with tumour necrosis activity. Nature, 1984, Vol. 312, no. 5996, pp. 721-724.
  8. Liepinsh D.J., Grivennikov S.I., Klarmann K.D., Lagarkova M.A., Drutskaya M.S., Lockett S.J., Tessarollo L., McAuliffe M., Keller J.R., Kuprash D.V., Nedospasov S.A. Novel lymphotoxin alpha (LTalpha) knockout mice with unperturbed tumor necrosis factor expression: reassessing LTalpha biological functions. Mol. Cell. Biol., 2006, Vol. 26, no. 11, pp. 4214-4225.
  9. Mana P., Linares D., Silva D.G., Fordham S., Scheu S., Pfeffer K., Staykova M., Bertram E.M. LIGHT (TNFSF14/CD258) is a decisive factor for recovery from experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol., 2013, Vol. 191, no. 1, pp. 154-163.
  10. Ruddle N.H., Waksman B.H. Cytotoxicity mediated by soluble antigen and lymphocytes in delayed hypersensitivity. 3. Analysis of mechanism. J. Exp. Med., 1968, Vol. 128, no. 6, pp. 1267-1279.
  11. Ruddle N.H., Bergman C.M., McGrath K.M., Lingenheld E.G., Grunnet M.L., Padula S.J., Clark R.B. An antibody to lymphotoxin and tumor necrosis factor prevents transfer of experimental allergic encephalomyelitis. J. Exp. Med., 1990, Vol. 172, no. 4, pp. 1193-1200.
  12. Suen W.E., Bergman C.M., Hjelmstrom P., Ruddle N.H. A critical role for lymphotoxin in experimental allergic encephalomyelitis. J. Exp. Med., 1997, Vol. 186, no. 8, pp. 1233-1240.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рисунок 1. Двойственная роль LTβR в развитии ЕАЕ: патогенная функция на ранней стадии EAE и защитная функция на поздних стадиях заболевания

Скачать (239KB)
Метаданные

© Гоголева В.С., Друцкая М.С., Недоспасов С.А., 2023

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах