Клиническая и иммунологическая эффективность иммуномодулирующего гексапептида, ассоциированная с восстановлением субпопуляций CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺ и CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺ нейтрофильных гранулоцитов у женщин с хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями органов малого таза

Полный текст

Введение

Несмотря на пристальное внимание исследователей к проблеме хронических воспалительных заболеваний органов малого таза (ХВЗОМТ), они по-прежнему занимают лидирующее место по частоте встречаемости среди гинекологических заболеваний [1, 2]. Частота хронических воспалительных заболеваний внутренних половых органов женщины обусловлена особенностями их клинического течения, создающими значительные трудности ранней диагностики воспалительного процесса, а также недостаточно высокой эффективностью стандартных методов лечения. Одной из причин затяжного течения воспалительного процесса и частого рецидивирования заболевания является несостоятельность защитных механизмов организма, которая проявляется в изменении клеточного и гуморального иммунитета, что способствует формированию или усугублению вторичной иммунной недостаточности и, как следствие, недостаточной эффективности стандартной терапии с развитием антибиотикорезистентности и преобладанием в качестве возбудителей условно-патогенных микроорганизмов и ко-инфицирования [5]. Хронические воспалительные процессы внутренних половых органов у женщин репродуктивного возраста следует рассматривать как общее полисистемное заболевание. Оно сопровождается вовлечением в патологический процесс систем, с которыми связано течение адаптационных процессов в организме женщины: иммунной, эндокринной, симпатоадреналовой, что свидетельствует о необходимости разработки комплексного подхода к лечению ХВЗОМТ с включением иммуномодулирующей терапии [4].

Одним из приоритетных направлений является изучение особенностей функционирования нейтрофильных гранулоцитов (НГ) при ХВЗОМТ, которые первыми осуществляют противобактериальную, противовирусную и противогрибковую защиту. Особый интерес представляет изучение рецепторного арсенала НГ, от которого зависит реализация полноценного иммунного ответа организма. «Противомикробная активность НГ ассоциирована с ведущими поверхностными мембранными рецепторами. СD16 (FcγRIII) – рецептор, отвечающий за цитотоксическое действие, дегрануляцию, кислородный взрыв и пролиферацию [3]. Повышение уровня экспрессии CD16 подтверждает функциональную активность НГ, а его низкий уровень на мембранной поверхности НГ характерен для незрелых НГ» [8]. «CD32 (FcγRII) – цитоплазматический иммунорецептор активации тирозина, экспрессия которого приводит в действие NADPH-оксидазный комплекс, опосредует эндоцитоз, стимулирует секреторную активность, цитотоксическое действие и иммуномодулирующию функцию НГ» [9]. «CD11b (Mac-1 или рецептор к компоненту комплемента CR3а) – сигнальный партнер для других рецепторов, регулирует хемотаксис НГ в очаг воспаления, адгезию, фагоцитоз, респираторный взрыв и дегрануляцию. Следствием блокировки CD11b является дефект в активации Fcγ-рецепторов и нарушение фагоцитарной функции НГ» [6]. «CD64 (FcγRI) – рецептор практически не экспрессируется на мембране НГ периферической крови здоровых лиц, а только на активированных НГ. Повышение экспрессии СD64 на мембране НГ происходит при бактериальной инфекции. Рецепторы CD64 и CD11b являются диагностическими маркерами бактериальной инфекции, тяжести заболевания, продолжительности и исхода воспалительного процесса» [7, 10].

В литературе описаны положительные клинико-иммунологические эффекты различных иммуномодулирующих препаратов, однако вопрос изучения таргетного воздействия иммунотропных препаратов на дефектно функционирующие НГ остается открытым. Учитывая иммуномодулирующий эффект гексапептида (ГП, аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин), являющегося синтетическим аналогом активного центра гомона тимуса тимопоэтина, представляет интерес возможность его влияния на фенотип и ассоциированную с ним функциональную активность НГ при лечении женщин с ХВЗОМТ.

Цель исследования – оценить эффект влияния гексапептида (ГП) на негативно измененные субпопуляции НГ CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺ и CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺, их фенотип и ассоциированные с ними эффекторные функции у иммунокомпрометированных женщин с ХВЗОМТ.

Материалы и методы

Проведено исследование НГ в образцах периферической крови (ПК) 35 женщин репродуктивного возраста от 20 до 40 лет с ХВЗОМТ в период обострения, поступивших в отделение дневного стационара Клиники ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России.

Были сформированы 2 группы исследования. Группа исследования 1 (ГИ1) – до начала комплексного лечения иммунокомпрометированных женщин с ХВЗОМТ в период обострения и группа исследования 1a (ГИ1а) – после комплексного лечения с включением иммуномодулирующей терапии. Группу сравнения составили 20 условно здоровых женщин репродуктивного возраста, обратившихся в клинику с целью контрацепции (установка внутриматочной спирали).

ХВЗОМТ у женщин ГИ1 характеризовались длительным анамнезом (более 5 лет), частыми обострениями (3 и более раз в год) и/или вялотекущим затяжным течением обострений, отсутствием стойкого клинического эффекта при использовании традиционной системной и местной противовоспалительной терапии.

В лечении использовали традиционные терапевтические подходы (антибактериальная, противогрибковая, противовоспалительная), а также дополнительно применяли иммуномодулирующую терапию, включающую препарат на основе ГП (действующее вещество лекарственного препарата Имунофан) в дозе 45 мкг/мл 1 мл внутримышечно 1 раз в сутки в течение 10 дней.

Тестирование НГ ПК проводилось у женщин с ХВЗОМТ до лечения (ГИ1) и через 2-3 дня после проведения комплексного лечения с включением препарата на основе ГП (ГИ1а) и у условно здоровых женщин.

В образцах периферической крови (ПК) определяли процентное содержания субпопуляций НГ (%НГ), одномоментно несущих CD11b, CD64, CD16, CD32-рецепторы, и плотность экспрессии данных рецепторов по MFI «методом проточной цитометрии (CYTOMICS FC500, США) с применением соответствующих моноклональных антител. Также была изучена фагоцитарная активность НГ с оценкой завершенности фагоцитоза со S. аureus (штамм 209), по показателям: количество активно фагоцитирующих НГ (%ФАН), процессов захвата (ФЧ, ФИ), переваривающей активности (%П, ИП); NADPH-оксидазная активность – по показателям спонтанного и стимулированного (S. aureus) NBT-теста, учитывая % формазан-позитивных НГ (%ФПК), средний цитохимический индекс (СЦИ), по соотношению %ФПКст/%ФПКсп рассчитывался коэффициент мобилизации (КМ)».

Для статистической обработки полученных данных использовались пакеты программ Microsoft Exсel 2016, StatPlus 2010 и непараметрические тесты – критерии Вилкоксона и Манна–Уитни. Результаты выражали в виде медианы (верхний и нижний квартиль) – Me (Q_0,25-Q_0,75). Статистически значимыми различия принимали при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

При оценке результатов исследования выявлено, что в образцах ПК группы сравнения (условно здоровые женщины) мажорная субпопуляция CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺НГ встречается в 94,90 (93,98-97,40) %, а минорная субпопуляция CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺НГ – в 1,24 (0,29-5,41) %.

У женщин ГИ1 в период обострения ХВЗОМТ выявлено снижение количественного состава мажорной субпопуляции, которая составила 87,6 (85,62-90,61)% (р < 0,05), а количество минорной субпопуляций имело тенденцию к увеличению и составило 5,44 (4,65;7,53)% относительно показателей группы сравнения (р > 0,05). Выявлена негативная трансформация фенотипа обеих субпопуляций. Так, в мажорной субпопуляции CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺НГ обращает на себя внимание снижение уровня экспрессии CD16 в 1,4 раза, CD11b в 2 раза (р < 0,05), а уровень CD32 не менялся относительно группы сравнения (р > 0,05). При этом в минорной субпопуляции CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺НГ отмечалось статистически значимое уменьшение плотности экспрессии CD16 по MFI – в 1,7 раза, CD11b в 2,1 раза (р < 0,05). Плотность экспрессии CD 32 также не менялась относительно группы сравнения (табл. 1).

 

ТАБЛИЦА 1. ИЗМЕНЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ CD11b⁺СD64^-СD32⁺CD16⁺, CD11b⁺СD64⁺СD32⁺CD16⁺ И ПЛОТНОСТИ ЭКСПРЕССИИ (MFI) ПОВЕРХНОСТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ СD64, CD16, CD32, CD11b У ИММУНОКОМПРОМЕТИРОВАННЫХ ЖЕНЩИН В ПЕРИОД ОБОСТРЕНИЯ ХВЗОМТ И ПОСЛЕ КОМПЛЕКСНОГО ЛЕЧЕНИЯ С ВКЛЮЧЕНИЕМ ГЕКСАПЕПТИДА, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 1. CHANGES IN THE SUBSET OF NEUTROPHIL GRANULOCYTES CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺, CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺ AND THE EXPRESSION DENSITY (MFI) OF SURFACE RECEPTORS CD64, CD16, CD32, CD11b IN IMMUNOCOMPROMISED WOMEN DURING THE EXACERBATION OF PID AND AFTER COMPLEX TREATMENT WITH THE INCLUSION OF HEXAPEPTIDE, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Показатель Indicator	Группа сравнения Comparison group	Группа исследования 1 (ГИ1) Study group (SG1)	Группа исследования 1а (ГИ1а) Study group 1a (SG1а)
CD11b+СD64-СD32+CD16+
%НГ %NG	94,9 (93,98-97,40)	87,6 (85,62-90,61)*	92,74 (91,96-96,93)^
MFI CD16	118 (108,00-146,25)	86 (64,95-92,55)*	100,00 (96,40-126,00)^
MFI СD32	3,79 (3,50-4,73)	3,57 (2,93-4,84)	3,23 (2,93-3,70)
MFI CD11b	25,10 (21,60-27,15)	12,2 (9,57-17,00)*	21,1 (18,77-25,60)^
CD11b+СD64+СD32+CD16+
%НГ %NG	1,24 (0,29-5,41)	5,44 (4,65-7,53)	3,33 (2,83-4,24)
MFI CD64	2,40 (2,07-5,06)	2,79 (1,73-7,61)	2,12 (1,76-2,71)
MFI CD16	149,00 (128,00-157,00)	89,9 (55,45-108,00)*	100,65 (75,82-129,75)
MFI СD32	5,84 (4,24-9,34)	5,71 (4,42-9,12)	4,24 (3,56-5,11)
MFI CD11b	33,70 (24,10-37,40)	15,8 (12,67-20,05)*	19,7 (17,70-23,00)*

Примечание. * – достоверность различий показателей от значений группы сравнения, р < 0,05; ^ – достоверность различий показателей по отношению к группе исследования 1, р < 0,05.

Note. *, the reliability of differences in indicators from the values of the comparison group, p < 0.05; ^, the reliability of differences in indicators in relation to research group 1, p < 0.05.

 

Изменения содержания функционально-значимых субпопуляций и негативная трансформация их фенотипа влияют на способность НГ полноценно осуществлять эффекторные функции. Выявлены дефекты функционирования системы НГ в виде отсутствия количественного прироста НГ в ответ на обострение хронического воспалительного процесса и снижения их эффекторных функций. Так, показано снижение %ФАН 54,0 (47,5-56,5) % против 61,0 (60,0-63,0) % в группе сравнения (p < 0,05), снижение переваривающей активности НГ – %П 40,6 (39,8-45,0) % против 56,0 (51,0-58,0) % в группе сравнения (p < 0,05), и ИП 0,8 (0,6-1,0) против 1,6 (1,4-2,4) в группе сравнения (p < 0,05). Нарушение NADPH-оксидазной активности связано отсутствием ответа как на воспалительный процесс в спонтанном NBT-тесте, так и на дополнительную индукцию S. aureus в стимулированном NBT-тесте (рис. 1). Дефекты эффекторных функций НГ иммунокомпрометированных женщин в период обострения ХВЗОМТ могут быть причиной поддержания хронического воспалительного процесса и отсутствия стойкого позитивного эффекта от проводимой этиопатогенетической терапии.

 

Рисунок 1. Показатели фагоцитарной и NADPH-оксидазной активности иммунокомпрометированных женщин в период обострения ХВЗОМТ на фоне лечения препаратом на основе гексапептида (процент от группы сравнения)

Примечание. * – достоверность различий показателей от значений группы сравнения, р < 0,05; ^ – достоверность различий показателей по отношению к группе исследования 1, р < 0,05.

Figure 1. Indicators of phagocytic and NADPH-oxidase activity of immunocompromised women during the period of exacerbation of PID against the background of treatment with a hexapeptide-based drug (percentage of the comparison group)

Note. *, the reliability of differences in indicators from the values of the comparison group, p < 0.05; ^, the reliability of differences in indicators in relation to research group 1, p < 0.05.

 

На фоне проводимой иммуномодулирующей терапии выявлены позитивные изменения иммунологических показателей. Так, в ГИ1а выявлено увеличение количества мажорной субпопуляции НГ до 92,74 (91,96-96,93) % относительно ГИ1 – 87,6 (85,62-90,61) % (p < 0,05), которое достигло уровня условно здоровых женщин (p > 0,05). Также отмечалось увеличение плотности экспрессии СD16 в 1,2 раза и СD11b в 1,7 раза относительно ГИ1 (p < 0,05). Количество минорной субпопуляции НГ имело тенденцию к снижению до 3,33 (2,83-4,24) относительно ГИ1 – 5,44 (4,65-7,53) % (p > 0,05). При этом наблюдалось увеличение уровня экспрессии CD11b в 1,3 раза относительно ГИ1 (p > 0,05). Плотность экспрессии CD16 увеличилась до 100,65 (75,82-129,75) против 89,9 (55,45-108) в ГИ1, достигнув показателей группы сравнения 149,00 (128,00-157,00) (p_{1, 2} > 0,05). Уровень экспрессии CD32 в обеих субпопуляциях НГ значимо не менялся.

Анализ показателей фагоцитарной и микробицидной активности НГ на фоне комплексной терапии с включением препарата на основе ГП выявил усиление фагоцитарной активности НГ, которое проявлялось в повышении количества «активно фагоцитирующих» НГ и, что особенно важно, киллинговой способности НГ. Так, в ГИ1а %П составил 47,3 (46,0-52,5) % против 40,6 (39,8-45,0) % в ГИ1 (p < 0,05) и достиг показателя группы сравнения 56,0 (51,0-58,0) (p > 0,05). Кроме того, отмечено и увеличение микробицидной активности каждого НГ – ИП составил 1,7 (1,5-3,0) против 0,8 (0,6-1,0) в ГИ1 и 1,6 (1,4-2,4) (p < 0,05) в группе сравнения (p > 0,05). Улучшение переваривающей активности НГ произошло, прежде всего, за счет активации кислородзависимых микробицидных механизмов (NADPH-оксидаз). При оценке NBT-теста отмечалось повышение %ФПК как в спонтанном, так и в стимулированном тесте с сохранением резервного потенциала НГ – КМ 2,0 (1,96-3,2) в ГИ1а после лечения против 1,34 (1,26-1,56) в ГИ1 до лечения (p < 0,05) (рис. 1).

Включение препарата на основе ГП в лечение иммунокомпрометированных женщин с ХВЗОМТ имело положительные иммунологические эффекты. Перепрограммирование негативно измененного фенотипа субпопуляций НГ в ГИ1а связано c увеличением количества мажорной субпопуляции CD11b⁺СD64^-СD32⁺CD16⁺НГ и уменьшением минорной субпопуляции CD11b⁺СD64⁺СD32⁺CD16⁺НГ, а также значительным изменением плотности экспрессии рецепторов, ответственных за эффекторные функции НГ – увеличением уровня экспрессии CD16 и CD11b в мажорной и минорной субпопуляциях. Кроме того, позитивные иммунологические эффекты связаны с восстановлением фагоцитарной и микробицидной активности НГ.

Одновременно на фоне комплексной терапии получены положительные клинические эффекты – регрессия воспалительного процесса при обострении ХВЗОМТ у иммунокомпрометированных женщин в виде уменьшения болевого синдрома, изменения характера и количества выделений из половых путей, субъективных ощущений. Оценка отдаленных результатов показала, что через 6 месяцев лечения в 88,6% случаев обострений ХВЗОМТ не было. Однако в 11,4% случаев возникло обострение ХВЗОМТ вследствие медицинских манипуляций (биопсия шейки матки, ЭКО с предшествующим введением глюкокортикостероидов) и незащищенных половых контактов. Кроме того, в 100% случаев как во время лечения препаратом на основе ГП, так и в более поздние сроки после лечения побочных эффектов иммунотерапии не зарегистрировано.

Заключение

Полученные в результате исследования иммуномодулирующие эффекты влияния препарата на основе ГП на негативно измененные субпопуляции НГ CD11b⁺СD64^-СD32⁺CD16⁺, CD11b⁺СD64⁺СD32⁺CD16⁺, ассоциированные с нарушением эффекторных функций НГ, обосновывают возможность его использования в комплексной терапии у иммунокомпрометированных женщин с ХВЗОМТ в период обострения. Применение препарата на основе ГП позволило реорганизовать субпопуляционный состав НГ и их оснащенность поверхностными мембранными рецепторами, что сопровождалось восстановлением их фагоцитарной и киллинговой активности. Позитивные иммуномодулирующие эффекты влияния препарата на основе ГП демонстрируют перспективные возможности его применения, направленные на коррекцию дефектного функционирования НГ у иммунокомпрометированных женщин с ХВЗОМТ в период обострения, что обеспечивает стойкую клинико-иммунологическую ремиссию и протективный эффект.

Об авторах

Светлана Валентиновна Ковалева

ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Автор, ответственный за переписку.
Email: 3483335@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9604-5806
Scopus Author ID: 55535685400
ResearcherId: AAB-3408-2020

д.м.н., доцент, старший научный сотрудник отдела клинико-экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии Центральной научно-исследовательской лаборатории, доцент кафедры клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Россия, г. Краснодар

И. В. Нестерова

ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ; ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы»

Email: inesterova1@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6071-4409
SPIN-код: 4714-2488
Scopus Author ID: 56553330300
ResearcherId: A-8785-2016

д.м.н., профессор, главный научный сотрудник отдела клинико-экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии Центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ; профессор кафедры клинической иммунологии, аллергологии и адаптологии факультета непрерывного медицинского образования Медицинского института, ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы»

Россия, г. Краснодар; Москва

Г. А. Чудилова

ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Email: chudilova2015@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8005-9325
SPIN-код: 2092-6412
Scopus Author ID: 6507554434
ResearcherId: AAB-2922-2020

д.б.н., доцент, заведующая отделом клинико-экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии Центральной научно-исследовательской лаборатории, профессор кафедры клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Россия, г. Краснодар

C. Н. Пиктурно

ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Email: spikturno@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9376-3397

аспирант кафедры клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Россия, г. Краснодар

Л. В. Ломтатидзе

ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Email: llomtatidze@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7041-7106
SPIN-код: 2060-9316
Scopus Author ID: 6507442505
ResearcherId: AAB-3414-2020

к.б.н., старший научный сотрудник отдела клинико-экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии Центральной научно-исследовательской лаборатории, доцент кафедры клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Россия, г. Краснодар

Список литературы

Дополнительные файлы