Роль NLRP3 в иммунопатогенезе нейродегенеративных заболеваний глаз

Полный текст

Введение

Нейродегенеративная патология глаз является ведущей причиной необратимого снижения центрального зрения и представляет собой гетерогенную группу заболеваний глаз, к которым относится глаукома. Недавно было подсчитано, что число людей с глаукомой во всем мире увеличится с 76,5 миллионов в 2020 году до 111,8 миллионов к 2040 году [8].

Первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) является многофакторным заболеванием. Повышенное внутриглазное давление (ВГД) считается доказанным фактором риска развития глаукомной оптиконейропатии (ГОН), однако до настоящего времени нет данных, объясняющих механизм повреждающего действия высокого внутриглазного давления [7]. Многими клиническими исследованиями было показано, что снижение ВГД позволяет предупредить развитие и прогрессирование ПОУГ [6, 7].

В развитии ПОУГ важная роль отводится локальному воспалительному ответу, индуцируемому звеном врожденного иммунитета – первой линией защиты организма от патогенов и продуктов тканевой деструкции.

Большое значение в данном процессе имеют паттерн-распознающие рецепторы, PRRs, среди которых в аспекте нейродегенеративных заболеваний в настоящее время активно изучаются NOD-подобные молекулы (NLR), и в частности сенсорный белок NLRP3, участвующий в распознавании лигандов патогенов и эндогенных сигналов повреждения. После активации NLRP3 вместе с прокаспазой-1 и адаптерным белком ASC образуют инфламмасому – комплекс, который запускает процессинг незрелых форм цитокинов про-IL-1β, про-IL-18 и активирует пироптоз.

Имеются данные, доказывающие, что формирование инфламмасом NLRP1, NLRP3 играет решающую роль в патогенезе острой глаукомы [2].

Похожие результаты получены в исследовании Yerramothu P. и соавт.: так, ими продемонстрирована сборка инфламмасом NLRP1, NLRP3 при моделировании острой глаукомой с высоким ВГД у мышей [11].

В модели острой глаукомы быстрое повышение ВГД, согласно данным Chi W., индуцировало HMGB1 опосредованную активацию инфламмасомы NLRP3 и продукцию зрелого IL-1β [2].

При ингибировании HMGB1 уровни NLRP3, IL-1β снижались, что, в свою очередь, приводило к уменьшению гибели ганглиозных клеток сетчатки и стабилизации ее толщины. Ингибирование каспазы-8 подавляло сборку инфламмасомы NLRP3 и продукцию IL-1β, что позволяет предположить наличие каспаза-8-сигнального пути активации NLRP1 и NLRP3 [3].

Также в исследовании Chi W. и соавт. было продемонстрировано, что в модели острого приступа глаукомы интравитреальное введение ингибиторов каспаз-1 и 8 значительно ослабляло остроту патологического процесса в глазу у экспериментальных животных [2].

Однако механизм участия инфламмасом в развитии нейродегенеративных заболеваний глаз остается невыясненным.

Структура и функциональная активность рецепторного белка NLRP3 и, соответственно, уровень воспалительного ответа зависят от полиморфных вариантов гена, кодируюшего NLRP3 [10]. В последнее время появляются данные о взаимосвязи полиморфизмов NLRP3 с различными заболеваниями. Так, Katharine M. von Herrmann и соавт. показали, что полиморфные варианты rs7525979 гена NLRP3 были связаны со значительным снижением риска развития Болезни Паркинсона [9]. В других научных работах обсуждается роль NLRP3 при глаукоме [4], однако данных о взаимосвязи полиморфизмов гена NLRP3 с риском развития ПОУГ в мировой и отечественной литературе не представлено.

Целью работы было изучение локальной экспрессии мРНК рецепторного белка NLRP3 при моделировании нейродегенеративной офтальмопатологии в эксперименте у кроликов и сопоставление полученных данных с распределением аллелей и генотипов полиморфного маркера rs 7525979 гена NLRP3 у пациентов с ПОУГ.

Материалы и методы

В ходе работы проводилось молекулярно-биологическое исследование, материалом для которого служили 28 образцов ТКС/РПЭ с моделированной дегенерацией сетчатки, выделенных из глаз экспериментальных животных согласно стандартным протоколам. Исследование выполнено с соблюдением международных принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным, принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского Сообщества (86/609/EC) «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Моделирование дегенеративного поражения сетчатки проводили в отделе патологии сетчатки и зрительного нерва ФГБУ «НМИЦ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России путем введения 14 кроликам (28 глаз) породы новозеландских альбиносов (опытная группа: возраст 2,5-3,0 мес., вес 2,0-2,5 кг) в субретинальное пространство на расстоянии 1-1,5 мм книзу от диска зрительного нерва 0,01 мл 0,9% раствора хлорида натрия с формированием субретинального пузыря согласно ранее разработанной методике [1]. О формировании нейродегенеративых изменений судили на основании изменений морфофункциональных параметров, полученных при проведении оптической когерентной томографии, исследовании аутофлюоресценции глазного дна, электроретинографии. В группу контроля были отнесены 7 соматически здоровых кроликов (14 глаз) без глазной патологии. Животных выводили из эксперимента методом воздушной эмболии после введения в наркоз (согласно приказу МинВуза СССР № 724 от 13.11.184), далее проводили энуклеацию глазных яблок. ТКС/РПЭ, выделенный из глаз, переносился в криопробирки и хранился при температуре -70 °C до проведения исследований. Образцы ТКС/РПЭ гомогенизировали. На следующем этапе выделяли мРНК с помощью набора Gene JET RNA Purification Kit (Thermo Scientific, США). Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора ОТ-1 фирмы «Синтол» (Россия). Полученные фрагменты кДНК амплифицировали методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на термоциклере ДТ-96 фирмы «ДНК-технология» (Россия). Для проведения ПЦР-РВ использовали наборы для определения экспрессии гена NLRP3, GAPDH («ДНК-синтез», Россия).

Для определения относительного количества кДНК в образце использовали метод нормированной экспрессии ÄÄCt. Результаты выражали в относительных единицах (отн. ед.).

Параллельно при проведении научной работы были изучены данные 238 пациентов в возрасте от 56 до 89 лет. На основании клинических и инструментальных исследования у 141 пациента диагностирована ПОУГ различных стадий, у остальных 97 пациентов признаки ПОУГ отсутствовали. Все пациенты подписывали информированное добровольное согласие на участие в исследованиях. Биоматериалом для проведения исследования служила венозная кровь: из нее при помощи коммерческих наборов «РИБО-сорб» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, РФ) была выделена ДНК, которая впоследствии была проанализирована на изучаемые полиморфные маркеры методом ПЦР-РВ. Для проведения ПЦР-РВ на исследование полиморфных маркеров в гене NLRP3 были использованы готовые коммерческие наборы фирмы «ДНК-синтез» (Россия).

Количественные данные описывались с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q_0,25-Q_0,75), процентных долей. При сравнении групп применен U-критерий Манна–Уитни. Распределение долей аллей и генотипов поверялось с помощью критерия хи-квадрат, критерия Фишера. Результаты описаны с помощью отношения шансов (ОШ) и 95% доверительного интервала для ОШ (ДИ). При оценке результатов статистически значимыми считали результаты при значениях р ≤ 0,05. Анализ и визуализацию полученных данных проводили с использованием компьютерной программы для статистической обработки данных – статистического пакета для социальных наук SPSS (Statistical Package for the Social Science).

Результаты и обсуждение

При исследовании экспрессии гена, кодирующего NLRP3, в ТКС/РПЭ животных основной группы и контроля выявлено, что дегенеративный процесс в сетчатке ассоциировался со значительным увеличением экспрессии гена NLRP3 по сравнению с группой контроля.

Анализ экспрессии генов компонентов инфламмасомного комплекса NLRP3 в группах кроликов представлен в таблице 1.

 

ТАБЛИЦА 1. АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ КОМПОНЕНТОВ ИНФЛАММАСОМНОГО КОМПЛЕКСА NLRP3 В ГРУППАХ ЖИВОТНЫХ

TABLE 1. ANALYSIS OF GENE EXPRESSION OF NLRP3 INFLAMMASOME COMPLEX COMPONENTS IN ANIMAL GROUPS

Группа Group	Уровень экспрессии (отн. eд.) Expression level
	NLRP3
	Me	Q0,25-Q0,75	p-value
Здоровые Healthy (n = 14)	0,0	0,0-24,4	0,004*
Дегенерация сетчатки Retinal degeneration (n = 14)	36,72	10,06-38,32

Примечание. * – статистически значимые результаты; n – количество кроликов.

Note. *, statistically significant results; n, number of rabbits.

 

На следующем этапе для пациентов основной группы с ПОУГ и группы сравнения проводилось генотипирование полиморфизма в гене NLRP3 (rs7525979). Результаты анализа представлены в таблице 2.

 

ТАБЛИЦА 2. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЧАСТОТ ГЕНОТИПОВ И АЛЛЕЛЕЙ ПО ПОЛИМОРФНЫМ ЛОКУСАМ ГЕНА NLRP3 У ПАЦИЕНТОВ С ПОУГ И В ГРУППЕ СРАВНЕНИЯ

TABLE 2. DISTRIBUTION OF FREQUENCIES OF GENOTYPES AND ALLELES BY POLYMORPHISM OF THE NLRP3 GENE IN PATIENTS WITH POAG AND CONTROL GROUP

Полиморфизм Polymorphism	Генотип / Аллель Genotype / allele	Группы Group		p-value, ОШ, ДИ OR, CI
		Пациенты с ПОУГ Patients with POAG (n = 141)	Группа сравнения Control group (n = 97)
rs7525979	ТC	0,42	0,17	÷2 = 0,002 р = 0,003 ОШ = 2,835 ДИ = 1,429-5,627
	TT	0,06	0,01	÷2 = 0,14 р = 0,24 ОШ = 4,27 ДИ = 0,505-36,015
	CC	0,52	0,82	÷2 = 0,001 р = 0,001 ОШ = 0,41 ДИ = 0,246-0,708
	Т	0,79	0,21	÷2 = 0,001 р = 0,001 ОШ = 3,16 ДИ = 1,62-6,13
	С	0,61	0,39	÷2 = 0,46 р = 0,56 ОШ = 0,8 ДИ = 0,45-1,43

Примечание. n – количество пациентов.

Note. n, number of patients.

 

При исследовании распределения аллелей полиморфного маркера rs7525979 гена NLRP3 было выявлено, что аллель Т ассоциирован с риском возникновения ПОУГ (р ≤ 0,05). При исследовании аллеля С в основной группе относительно группы сравнения статистически значимых различий выявлено не было (p > 0,05). При исследовании распределения генотипов по полиморфному маркеру rs7525979 гена NLRP3 было выявлено, что гетерозиготный генотип ТС значительно чаще встречался в группе пациентов с ПОУГ относительно группы сравнения и увеличивал риск развития заболевания в 2 раза (р ≤ 0,05). Гомозиготный аллель СС значительно чаще встречался в группе сравнения, играя протективную роль (р ≤ 0,05). При исследовании гомозиготного генотипа ТТ статистически значимых различий найдено не было.

В последнее время появляется все больше данных о роли локального воспаления при развитии глаукомы. В своей работе Hui Chen и др. на модели острой глаукомы, выполненной на мышах линий C57BL/6, NLRP12^-/-, GSDMD^-/-, описали гибель ганглиозных клеток сетчатки, опосредованную действием пироптоза с участием в том числе инфламмасомного комплекса NLRP3, NLRP12 [5]. Полученные нами данные на модели кроликов с дегенерацией сетчатки показали высокую экспрессионную активность гена NLRP3. При исследовании полиморфного маркера гена NLRP3 в венозной крови пациентов с ПОУГ также были выявлены значимые ассоциативные связи. Все это указывает на большую роль гена NLRP3 в иммуннопатогенезе нейровоспаления и усилении нейродегенеративных процессов при ПОУГ.

Заключение

Для более глубокого понимания патогенеза развития нейродегенеративных патологий глаз, персонализированного подхода к лечению пациентов и прогнозирования у них течения заболеваний необходимо расширять наши знания о роли генетических факторов. В нашей работе мы изучили роль гена NLRP3 в иммуннопатогенезе нейровоспаления глаз на моделях in vivo и in vitro и выявили сопоставимую ассоциацию данного гена с риском развития нейродегенеративных процессов органа зрения. Эти данные могут быть использованы в разработках иммуномодулирующей терапии для предотвращения тяжелого течения и развития осложнений при нейродегенеративных патологиях глаз.

Об авторах

Н. В. Балацкая

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней имени Гельмгольца» Министерства здравоохранения РФ

Email: balnat07@rambler.ru

к.б.н., ведущий научный сотрудник, начальник отдела иммунологии и вирусологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней имени Гельмгольца» Министерства здравоохранения РФ

Россия, Москва

Т. В. Гаврилова

ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения РФ

Email: gavrilova.tv@mail.ru

д.м.н., профессор, член-корр. РАН, заведующая кафедрой офтальмологии ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения РФ

Россия, г. Пермь

Алия Ряшидовна Кинкулькина

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский университет)

Автор, ответственный за переписку.
Email: mech.inst@mail.ru

аспирант кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии имени А.А. Воробьева Института общественного здоровья имени Ф.Ф. Эрисмана ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский университет); младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Россия, Москва; Москва

А. С. Авагян

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский университет)

Email: avagyan.asmik@list.ru

студентка ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский университет); лаборант лаборатории молекулярной иммунологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Россия, Москва; Москва

О. А. Свитич

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Email: svitichoa@yandex.ru

д.м.н., член-корр. РАН, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии имени А.А. Воробьева Института общественного здоровья имени Ф.Ф. Эрисмана ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский университет); директор ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы