Получение миелоидных супрессорных клеток из моноцитов периферической крови in vitro

Полный текст

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 22-25-00378).

Введение

Миелоидные супрессорные клетки (MDSC) – немногочисленная популяция клеток миелоидного происхождения, включающая в себя подобные нейтрофилам (PMN-MDSC) и моноцитам (M-MDSC) клетки, способные подавлять иммунный ответ, в том числе и противоопухолевый. Количество MDSC в периферической крови увеличивается при таких патологиях, как рак, хроническое воспаление, сепсис, аутоиммунные заболевания, и в норме – во время беременности [1]. Кроме того, происходит накопление миелоидных супрессоров непосредственно в микроокружении опухоли, в местах аутоиммунного воспаления, в плаценте [3].

Механизм иммуносупрессивного действия MDSC опосредован поверхностными молекулами CD73, ADAM17, PD-L1, Gal-9 и CD40, цитокинами IL-10, TGF-β и активными формами кислорода. Помимо этого, MDSC способны истощать в среде аминокислоты аргинин и триптофан, используя для этого ферменты индуцибельную NO-синтазу и аргиназу 1 (Арг 1).

Являясь одними из самых мощных иммуносупрессивных клеток, MDSC способствуют прогрессированию опухоли, ингибируя противоопухолевые функции Т- и NK-клеток. Помимо этого, MDSC напрямую стимулируют развитие опухоли, способствуя неоваскуляризации и инвазии опухолевых клеток, создают предметастатическую среду [3] и играют большую роль в возникновении резистентности опухоли к противораковой терапии [5].

Безусловно, нельзя говорить об однозначно негативном значении миелоидных супрессоров для организма. Их важная биологическая роль заключается в обеспечении иммунной толерантности матери к плоду [6]. Кроме того, MDSC принимают участие в поддержании гомеостаза, ангиогенезе и заживлении ран [10].

Однако знания о месте MDSC в аутоиммунитете находятся в стадии накопления. В ряде исследований описаны полезные функции этих клеток при аутоиммунных заболеваниях, подтверждающие возможность использования MDSC в терапии соответствующих патологий [2].

Что касается роли миелоидных супрессоров в трансплантационном иммунитете, ряд научных коллективов на моделях животных показали, что MDSC способствуют выживанию аллотрансплантатов при пересадке кожи, роговицы и сердца [15]. Помимо этого, есть данные о том, что процент реципиентов с 1- и 5-летней выживаемостью трансплантатов был выше в группе с высоким уровнем MDSC. По этой причине интерес к данным клеткам в качестве агентов клеточной терапии, способных улучшать приживаемость аллогенных трансплантатов, постоянно растет.

Важно подчеркнуть, что разработка терапевтических подходов, основанных на манипулировании MDSC, требует их выделения и/или пролиферации in vitro.

В основном получение миелоидных супрессоров человека с целью их исследования основано на выделении из крови онкологических больных либо на генерации из стволовых клеток. Однако сбор стволовых клеток костного мозга, как и забор крови у больных раком, сопряжен с этическими проблемами, поиском пациентов/доноров и получением добровольного информированного согласия.

На сегодняшний день имеются работы, описывающие более доступную in vitro индукцию MDSC из клеток периферической крови. В качестве факторов, индуцирующих дифференцировку MDSC вне организма человека, описаны GM-CSF, IL-6, IL-1β, IL-4, PGE2, LPS, M-CSF, IFNγ. Однако, несмотря на кажущееся разнообразие существующих вариантов, не все схемы однозначно воспроизводимы и приводят к генерации достаточного количества клеток целевой популяции.

Нами была разработана схема дифференцировки MDSC из CD11b⁺ клеток периферической крови человека [11], которая позволила получить ощутимый, но все же недостаточный для исследований функциональной активности процент клеток.

Поиск способов увеличения пула MDSC натолкнул нас на исследования, касающиеся дедифференцировки моноцитов и получения программируемых клеток моноцитарного происхождения [13].

Моноциты периферической крови по сути являются клетками-предшественниками, которые при соответствующей стимуляции мигрируют к местам воспаления и проникают в ткани, приобретая характеристики активированных макрофагов. В качестве альтернативы они способны созревать в несколько классов резидентных тканевых макрофагов [4]. Описано несколько популяций культивируемых клеток человека, происходящих из циркулирующих моноцитов и обладающих способностью дифференцироваться в нефагоциты [8]. Ungefroren H. и соавт. разработали протокол для получения из моноцитов человека «программируемых клеток моноцитарного происхождения» (ПКМО, PCMO), обладающих повышенной пластичностью. Во время 6-дневной дедифференцировки (обработки макрофагальным колониестимулирующим фактором (M-CSF) и интерлейкином-3 (IL-3)) клетки подавляли экспрессию ряда маркеров, связанных с иммунными функциями моноцитов, таких как CD14, TLR-2, TLR-4, TLR-7, TLR-9, а также цитозольной субъединицы NADPH оксидазы p47phox. Кроме того, PCMO эндогенно экспрессировали различные маркеры эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека и были способны индуцироваться при наличии соответствующих сигналов в клетки, напоминающие эндотелиоциты, хондроциты и остеобласты.

Эти результаты показали, что в среде, содержащей соответствующие факторы роста, моноциты периферической крови могут быть, по крайней мере частично, перепрограммированы без экзогенного введения факторов плюрипотентности.

Таким образом, целью нашего исследования была дифференцировка MDSC из моноцитов периферической крови человека in vitro с целью получения достаточного количества клеток целевой популяции.

Материалы и методы

Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией ВМА 2000 г. и Протоколом к Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г. На используемую экспериментальную схему получено одобрение Комитета по этике ИЭГМ УрО РАН (IRB00010009) от 15 февраля 2022 г., протокол № 15. У всех пациентов было получено письменное информированное согласие.

Объект исследования. Образцы венозной крови были взяты у здоровых доноров (небеременные женщины, n = 4, возраст 25-39 лет) путем венопункции с помощью вакуумных пробирок BD Vacutainer^TM, Greiner-bio-one, Австрия). Мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности (р = 1,077 г/см³, «Диаколл», «Диаэм», Россия).

Дифференцировка CD14⁺ клеток. CD14⁺ клетки выделяли из МПК с помощью позитивной иммуномагнитной сепарации (MacsiBeads, колонки MS, (Miltenyi Biotec, Германия)). Выделенные CD14⁺ клетки культивировали в 96-луночных планшетах (1 × 10⁶ клеток/мл, 200 мкл) в полной питательной среде (среда RPMI 1640 (Sartorius) с добавлением 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина (оба из ICN Pharmaceuticals, США), пенициллин-стрептомицин-амфотерицина B (BI, Израиль)) и 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (Corning, США) во влажной атмосфере в CO₂ – инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂ в течение 14 дней с 3-кратной заменой среды. Чтобы поляризовать CD14⁺ в клетки MDSC, на первом этапе мы культивировали клетки в течение 6 дней в среде для дедифференцировки, состоящей из среды RPMI 1640 с 50 мкмоль/ мл β-меркаптоэтанола (для удаления активных форм кислорода), 5 нг/мл M-CSF и 0,4 нг/мл человеческого IL-3. На 4-й день среду заменяли на свежую [13]. На 7-й день проводили замену среды на среду RPMI 1640 с добавлением 20 нг/ мл GM-CSF. На 10-й день вновь осуществляли смену среды на среду RPMI 1640 с добавлением 20 нг/мл IL-1β и 0,1 мкг/мл LPS [11].

На 14-й день культивирования осуществляли снятие культур и окрашивание клеток. Жизнеспособность клеток после 14-дневной инкубации оцененивали с помощью окрашивания устойчивым к фиксации красителем Zombie Aqua (ZA) (Invitrogen, США). Подготовку образцов для окрашивания поверхностных клеточных молекул проводили в соответствии с инструкциями производителя антител (R&D, США).

Использовали следующую панель антител для поверхностного окрашивания: анти-HLA-DR-Alexa Fluor 750, анти-CD33-APC, анти-CD11b-Alexa Fluor 405, анти-CD66b-PE, анти-CD14-PerCP (R&D Systems, США). Для исключения лимфоцитов и NK-клеток из целевого гейта использовали антитела: анти-CD19-AF700, анти-CD56-AF700, анти-CD3-AF700. Пробоподготовку для внутриклеточного окрашивания проводили при помощи реагентов BioLegend (США). Для детекции внутриклеточных аргиназы-1 (Арг 1) и индоламин 2,3-диоксигеназы (ИДО) использовали антитела и изотипические контроли Anti-human/mouse Arginase 1-Alexa Fluor 488 и Rat IgG 2a Kappa isotype control – Alexa Fluor 488, Invitrogen; Anti human IDO (AF488) и mouse IgG1 control (AF488), R&D Systems (Biotechne, США). Пробы FMO (fluorescence minus one) и изотипические контроли использовали для разделения «негативных» и «позитивных» популяций. Образцы анализировали на проточном цитометре CytoFLEX S (Beckman Coulter, США). Определяли процент общей популяции MDSC (Lin^-HLA-DR^-CD11b⁺CD33⁺) от живых клеток, а также процент M-MDSC (Lin^-HLA-DR^-CD11b⁺CD33⁺CD14⁺CD66b^-) и PMN- MDSC (Lin^-HLA-DR^-CD11b⁺CD33⁺ CD66b⁺CD14^-) от всех MDSC. После гейтирования ZA-Lin^-CD11b⁺CD33⁺ клеток на отдельных гистограммах определяли процент Arg⁺ и IDO⁺ клеток.

Данные проточной цитометрии обрабатывали с помощью программы CytExpert (Beckman Coulter, США). Статистическую обработку данных проводили в программе GraphPad Prizm 8.0.1 с использованием критерия Манна–Уитни. Результаты представлены в виде медианы, нижнего квартиля и верхнего квартиля – Me (Q_0,25-Q_0,75). Уровень значимости был принят за 0,05.

Результаты и обсуждение

Обнаружено, что дифференцировка MDSC из СD14⁺ клеток сопровождалась статистически значимым, но незначительным снижением жизнеспособности клеток в культуре. Зафиксировано снижение процента живых клеток по сравнению с предыдущей схемой дифференцировки MDSC с 98,32 (97,88-98,71) в культуре CD11b⁺ клеток до 97,28 (96,15-97,86) в культуре (p = 0,024).

В среднем относительное количество клеток, которые можно отнести к общей популяции MDSC, в новой схеме дифференцировки из CD14⁺ клеток было выше, чем в эксперименте с CD11b⁺ клетками. Максимальный процент HLA- DR^-Lin^-CD11b⁺CD33⁺ клеток достигал 67, в то время как в предыдущей схеме – только 43. Тем не менее статистически значимых отличий по этому показателю между двумя схемами выявлено не было (табл. 1).

 

ТАБЛИЦА 1. ПРОЦЕНТ MDSC, PMN-MDSC И MDSC, СОДЕРЖАЩИХ Арг1 И ИДО В КУЛЬТУРАХ СD11b⁺ И CD14⁺ КЛЕТОК, ИНДУЦИРОВАННЫХ В МИЕЛОИДНЫЕ СУПРЕССОРЫ; n = 4, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 1. PERCENTAGE OF MDSC, PMN-MDSC AND MDSC CONTAINING Arg1 AND IDO IN CULTURES OF CD11b⁺ AND CD14⁺ CELLS INDUCED INTO MYELOID-DERIVED SUPPRESSOR CELLS; n = 4, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Источник Source	MDSC %	PMN-MDSC %	Арг1+ Arg 1+ %	ИДО+ IDO+ %
CD11b+ клетки CD11b+ cells	34,21 (11,79-43,29)	2,155 (0,26-7,87)	39,49 (33,80-45,33)	43,59 (34,53-57,55)
CD14+ клетки СD11b+ cells	39,75 (22,21-66,75)	0,815 (0,475-1,935)	50,5 (45,36-56,43)	60,54 (47,76-69,97)

 

Процент клеток, содержащих Арг 1 и ИДО также имел тенденцию к повышению в культурах, содержащих CD14⁺ клетки в качестве предшественников MDSC. Однако процент PMN- MDSC, который и в предыдущей схеме был крайне невысоким, в новой модели имел тенденцию к снижению (табл. 1).

Процент «зрелых» M-MDSC, т. е. HLA- DR^-CD33⁺CD11b⁺ клеток, несущих на поверхности молекулу СD14, в схеме дифференцировки супрессоров из моноцитов периферической крови был в среднем выше в 3 раза, чем в модели получения MDSC из CD11b⁺ клеток (рис. 1). Важно отметить, что, процент M-MDSC был сопоставим с количеством клеток, содержащих Арг 1 и ИДО, что является подтверждением их функциональной состоятельности.

 

Рисунок 1. Процент M-MDSC от общей популяции MDSC, полученных из CD14⁺ клеток

Примечание. n = 4; по оси абсцисс – вид клеток, из которых дифференцировали MDSC; по оси ординат – процент M-MDSC в гейте общей популяции миелоидных супрессоров. Показаны медианы (горизонтальные линии), межквартильные размахи (прямоугольники), максимальные и минимальные значения («усы»). Указано значение p < 0,05 по отношению к культурам СD11b⁺ клеток.

Figure 1. Percentage of M-MDSCs from the total population of MDSCs derived from CD14⁺ cells

Note. n = 4; x axis, the type of cells from which MDSC was differentiated; y-axis, percentage of M-MDSC in the gate of the total population of myeloid suppressors. Medians (horizontal lines), interquartile ranges (rectangles), maximum and minimum values (“whiskers”) are shown. The p < 0.05 value is indicated in relation to CD11b⁺ cell cultures.

 

Как мы уже упоминали, получение функционально активных MDSC in vitro имеет большую практическую значимость для разработки клеточных технологий, использующих иммунорегуляторную способность этих клеток для терапии аутоиммунных патологий и посттрансплантационных осложнений.

С момента первых работ, описывающих миелоидные супрессоры, прошло более сорока лет. С начала двухтысячных годов ведутся исследования по получению MDSC в лабораторных условиях. Помимо дифференцировки супрессоров из стволовых клеток описаны методы их генерации из клеток крови in vitro с добавлением различных цитокинов и ростовых факторов, а также при сокультивировании с опухолевыми линиями клеток [9].

Ранее нашим коллективом были опробованы методы генерации MDSC из разных типов клеток периферической крови. В качестве клеток-предшественников мы использовали мононуклеары периферической крови, изолированные CD33⁺ и СD11b⁺ клетки. В качестве молекул индукции – GM-CSF, IL-1β, IL-6, LPS, IFNγ. Время инкубации варьировало от одной недели до трех недель [11].

В целом по увеличению процента выхода целевой популяции клеток в наших экспериментальных культурах можно выстроить клетки-предшественники MDSC следующим образом: мононуклеары периферической крови – CD33⁺ клетки – СD11b⁺ клетки – СD14⁺ клетки. Однако нужно понимать, что однозначный вывод можно сделать только устранив вариации во времени культивирования, в добавляемых молекулах-индукторах и их концентрациях. Но все же можно выделить общую для всех использованных нами схем тенденцию. Во всех культурах клеток количество M-MDSC превышало количество PMN-MDSC, причем иногда в более чем в десять раз. Можно предположить, что для дифференцировки PMN-MDSC в наших экспериментальных условиях необходимо наличие менее зрелого костномозгового миелоидного предшественника. Интересно, что у больных раком людей и у животных с опухолями PMN-MDSC способны дифференцироваться из M-MDSC, за что ответственно эпигенетическое подавление транскрипции гена ретинобластомы Rb1 [14].

Отличия М-МDSC от PMN-MDSC, которые можно назвать преимуществами для биомедицинских исследований, касающихся индукции толерантности к трансплантату, в том, что они не требуют прямого контакта с Т-клетками для подавления их иммунного ответа, а их супрессивное действие является неспецифическим. Кроме того, есть данные, что M-MDSC в пересчете на одну клетку эффективнее PMN-MDSC. Еще одной важной особенностью M-MDSC является их способность поддерживать размножение регуляторных T-клеток in vitro [7].

Заключение

Таким образом, нами разработана эффективная методика получения достаточного количества функционально активных M-MDSC из моноцитов периферической крови в количестве, позволяющем проводить дальнейшие исследования по манипулированию функциями этих клеток.

Об авторах

Валерия Павловна Тимганова

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Автор, ответственный за переписку.
Email: timganovavp@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4581-1969

к.б.н., научный сотрудник лаборатории клеточной иммунологии и нанобиотехнологии, Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Россия, г. Пермь

К. Ю. Шардина

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Email: shardinak@gmail.com

инженер-исследователь лаборатории клеточной иммунологии и нанобиотехнологии, Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Россия, г. Пермь

М. С. Бочкова

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Email: krasnykh-m@mail.ru

к.б.н., научный сотрудник лаборатории клеточной иммунологии и нанобиотехнологии, Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Россия, г. Пермь

Д. И. Усанина

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Email: usanina_d@mail.ru

инженер лаборатории клеточной иммунологии и нанобиотехнологии, Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Россия, г. Пермь

С. А. Заморина

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Email: mantissa7@mail.ru

д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории клеточной иммунологии и нанобиотехнологии, Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Россия, г. Пермь

Список литературы

Дополнительные файлы