КООПЕРАТИВНОЕ ВЛИЯНИЕ ПОЛОВЫХ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ И ГОРМОН-СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИИДИОТИПИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ ОПУХОЛИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Полный текст

Кооперативное влияние половых стероидных гормонов и гормон-специфических антиидиотипических антител на пролиферацию опухоли у больных раком молочной железы

 

Введение

Основной причиной онкологической смертности женского населения России и других экономически развитых стран остаётся рак молочной железы (РМЖ) [5]. Несмотря на повышенный рост заболеваемости, смертность от РМЖ снижается за счёт повышения эффективности ранней диагностики и лечения. Это достигается путём широкого использования биологических маркеров наследственного РМЖ и молекулярных подтипов РМЖ [4, 7]. В частности, содержание в опухоли рецепторов стероидных гормонов и эпидермального фактора роста, а также протеина Ki-67, маркера клеточной пролиферации, являются наиболее значимыми прогностическими маркерами, влияющими на вероятность рецидивирования у больных с I стадией РМЖ [3]. Поэтому исследование внеклеточных факторов, влияющих на экспрессию соответствующих генов, представляет собой не только теоретический, но и сугубо практический интерес.

Хорошо известны геномные и внегеномные эффекты стероидных гормонов, эстрадиола и прогестерона (E2 и Pg), опосредованные, соответственно, цитозольными и мембранными рецепторами (ER и PR) [11, 17, 18, 19, 20, 24].

Гораздо меньше внимания уделялось натуральным ауто-антителам, специфичным к рецепторам стероидных гормонов, несмотря на то, что, начиная с 1990-х годов в различных модельных экспериментах было убедительно продемонстрировано их внегеномное действие на опухолевые клетки молочной железы [10, 15, 16, 22]. В единичных клинических исследованиях показана прямая корреляция уровней ауто-антител, специфичных к ERα с количеством Ki-67 позитивных клеток РМЖ [14]. Одновременно высокие уровни антиидиотипических антител, связывающихся с моноклональными антителами, специфичными к E2 и Pg (и по определению способных к связыванию с мембранными ER и PR) обнаруживали у больных с I стадией РМЖ чаще, чем у здоровых женщин [6] и у больных с ER-PR- опухолями при II–IV стадиях, чем при I стадии [1].

Однако, совместное влияние ауто-антител против ER и PR (в том числе, указанных антиидиотипических, IgG₂-E2 и IgG₂-Pg) в кооперации с самими гормонами (E2 и Pg) на пролиферативную активность опухоли у больных РМЖ оставалось неизвестным.

Цель настоящего исследования -  выявить предполагаемые взаимосвязи между содержанием в сыворотке крови антиидиотипических ауто-антител, IgG₂-E2 и IgG₂-Pg, и стероидных гормонов, E2 и Pg, с одной стороны, и содержанием в опухоли Ki-67 положительных клеток, с другой стороны, у больных РМЖ.

Материалы и методы

Объектом исследования в данной работе послужила сыворотка крови 907 женщин с первично установленным диагнозом «инвазивная карцинома молочной железы неспецифического типа» в постменопаузе. Все женщины первично обратились в Кузбасский клинический онкологический диспансер г. Кемерово. По TNM классификации у большинства женщин была диагностирована I и II стадии заболевания (47,4% и 38,1% соответственно), III и IV стадии были выявлены у 13,2% и 1,2% женщин соответственно. Данные о величине маркера пролиферативной активности опухолевой клетки Ki-67 были взяты из протоколов патологоанатомического отделения. Медиана возраста всех женщин составила 65 лет (интерквартильный размах 60–71).

Периферическая кровь забиралась у всех женщин в соответствии с этическими принципами Хельсинской декларации (2013 г.) и согласно «Правилами клинической практики в Российской Федерации» (Приказ Минздрава РФ № 266 от 19.06.2003 г.). Все женщины предоставили письменное информированное согласие на участие в обследовании.

Анализ антиидиотипических антител, специфичных к E2 и Pg (IgG₂-E2, IgG₂-Pg), осуществляли с помощью коммерческих наборов «ИммуноФА-Эстрадиол» и «ИммуноФА-ПГ» («Иммунотех», г. Москва) с иммобилизованными на пластике моноклональными антителами против E2 в Pg в качестве антигенов согласно методике [2]. Антиидиотипические антитела против стероидных гормонов, связавшиея с моноклональными антителами против Е2 и Pg, выявляли с помощью козьих антител против IgG человека, меченных пероксидазой хрена (Invitrogen, США), с разведением 1/30000. Уровни IgG₂-E2 и IgG₂-Pg выражали в условных единицах (у.е.) и рассчитывали по формуле:

IgG₂ - X = (OD_X-мАТ - OD_фон) / OD_фон

где X = E2 или Pg; OD_X-мАТ – оптическая плотность связывания сывороточных антиидиотипических антител с моноклональными антителами против E2 или Pg, OD_фон – оптическая плотность фонового связывания меченных пероксидазой хрена козьих антител против IgG человека с моноклональными антителами против E2 или Pg без добавления сыворотки крови.

Концентрацию стероидных гормонов (E2, Pg) определяли с помощью коммерческих наборов «ИммуноФА-Эстрадиол», «ИммуноФА-ПГ» («Иммунотех», г. Москва) согласно инструкции по применению.

Для статистической обработки полученных результатов использовали программу Statistica 8.0 (StatSoft Inc., USA). Оценку характера распределения признаков осуществляли с помощью W-критерий Шапиро-Уилка. Так как распределение признаков имело ненормальный характер, далее использовали непараметрический критерий χ² с поправкой Йейтса на непрерывность вариации. Критический уровень значимости принимался p<0,05. Пороги отсечения антител и гормонов (cut-off value), по которым сравниваемые группы имели оптимальные различия, были рассчитаны с помощью ROC-анализа [12]. 

 

Результаты

Исследование экспрессии в опухоли маркера клеточной пролиферации – протеина Ki-67 у больных РМЖ показало следующее (табл. 1). Удельный вес больных с низким содержанием в опухоли Ki-67 положительных клеток (≤14%) при II–IV стадиях был ниже, чем при I стадии (23,1% против 38,8%), а с высоким содержанием Ki-67 положительных клеток соответственно выше (54,9% против 31,9%). По среднему уровню Ki-67 (15–30%) различия оказались несущественными (29,3% и 22,0%). Таким образом, на исследуемой выборке больных подтверждены общеизвестные данные об усилении пролиферативной активности опухоли при прогрессии РМЖ.

 

Таблица 1. Число (n) и удельный вес (%) больных раком молочной железы (РМЖ) в зависимости от содержания в опухоли клеток, экспрессирующих белок Ki-67

Table 1. Numbers (n) and prevalence (%) of breast cancer patients (BCP) according to levels of tumor Ki-67 expressing cells

Группы Groups	Ki-67			χ2 (р) df = 2
	≤14	15–30	>30
	n/%	n/%	n/%
I стадия РМЖ I stage BCP	167/38,8	126/29,3	137/31,9	50,5 (<0,001)
II–IV стадии РМЖ II–IV stages BCP	110/23,1	105/22,0	262/54,9

 

Для изучения совместного участия половых стероидных гормонов и гормон-специфических антиидиотипических антител в регуляции пролиферативной активности опухоли рассчитали с помощью ROC-анализа пограничные значения (cut-off) концентраций E2 и Pg и уровней IgG₂-E2 и IgG₂-Pg в сыворотке крови, по которым больные РМЖ I стадии с содержанием в опухоли минимального (≤14%) и максимального (>30%) количества Ki-67 положительных клеток. Таковыми значениями оказались: для E2 – 200 pmol/L; для Pg – 600 pmol/L; для IgG₂-E2 – 3,5 у.е.; для IgG₂-Pg – 2,5 у.е.

В таблице 2 приведены результаты анализа распределения больных РМЖ по содержанию в опухоли Ki-67 экспрессирующих клеток с учётом низких (≤) и высоких (>) концентраций в сыворотке E2 и Pg, а также их четырёх возможных комбинаций. Выяснилось, что у больных с I стадией РМЖ опухоли с низким содержанием Ki-67 положительных клеток (≤14%) встречались реже, а с высоким (>30%) чаще при концентрации E2>200, чем при E2≤200 (позиции 1.1 и 1.2). Однако, эти различия не достигали статистической достоверности (р = 0,08). Искомые различия были статистически значимы при сравнении низких (≤600) и высоких (>600) концентраций Pg (позиции 2.1 и 2.2: 46,0% против 33,5% и 23,2% против 38,4%, соответственно; р = 0,003).

 

Таблица 2. Число (n) и удельный вес (%) больных раком молочной железы (РМЖ) с различным содержанием в опухоли Ki-67 экспрессирующих клеток в зависимости от концентрации (pmol/L) в сыворотке крови эстрадиола и прогестерона (E2 и Pg)

Table 2. Numbers (n) and prevalence (%) of breast cancer patients (BCP) with different levels of tumor Ki-67 expressing cells according to estradiol and progesterone (E2 and Pg) serum concentration (pmol/L)

Гормоны и их комбинации Hormones and their combinations	РМЖ I стадия I stage BCP (N = 430)			РМЖ II–IV стадии II–IV stages BCP (N = 477)			χ2 (p) df = 2
	Ki-67 ≤14	Ki-67 15–30	Ki-67 >30	Ki-67 ≤14	Ki-67 15–30	Ki-67 >30
	n/%	n/%	n/%	n/%	n/%	n/%
1.1. E2≤200 1.2. E2>200	108/42,7 59/28,5	74/24,2 52/25,1	71/28,1 66/46,4	55/22,5 55/23,6	59/24,2 46/19,7	130/53,3 132/56,7	36,1 (<0,001) 15,1 (<0,001)
χ2(р), df = 2	5,1 (0,08)			1,4 (0,50)
2.1. Pg≤600 2.2. Pg>600	85/46,0 82/33,5	57/30,8 69/28,1	43/23,2 94/38,4	40/22,6 70/23,3	50/28,3 55/18,3	87/49,1 175/58,4	31,4 (<0,001) 21,6 (<0,001)
χ2(р), df = 2	12,0 (0,003)			6,7 (0,04)
3.1 E2≤200      +Pg≤600	57/47,1	39/32,2	25/20,7	28/25,7	29/26,6	52/47,7	20,3 (<0,001)
3.2. E2>200      +Pg≤600	28/43,8	18/28,1	18/28,1	12/17,6	21/30,9	35/51,5	11,9 (0,003)
3.3. E2≤200      +Pg>600	51/38,6	35/26,5	46/34,9	27/20,0	30/22,2	78/57,8	15,9 (<0,001)
3.4. E2>200      +Pg>600	31/27,4	34/30,1	48/42,5	43/26,1	25/15,1	97/58,8	10,5 (0,006)
3.5. (3.1+3.2+3.3)	136/42,9	92/29,0	89/28,1	67/21,5	80/25,6	165/52,9	46,9 (<0,001)
χ2 (р), df = 6	16,5 (<0,05)			11,2 (>0,05)
χ2 (р3.1-3.4), df = 2	15,0 (<0,001)			5,9 (0,05)
χ2 (р3.5-3.4), df = 2	10,6 (0,006)			7,1 (0,03)

 

 

У больных с I стадией РМЖ при одновременно низких концентрациях E2 и Pg (позиция 3.1) или одного из них при высокой концентрации другого (позиции 3.2 и 3.3) удельный вес опухолей с низким содержанием Ki-67 положительных клеток составлял 38,6–47,1%, а с высоким - 20,7–34,9%. У больных с одновременно высокими концентрациями E2 и Pg (позиция 3.4) соответствующие показатели равнялись 27,4% и 42,5%. Различия между этими четырьмя подгруппами больных с I стадией РМЖ по удельному весу опухолей с разным содержанием в опухоли Ki-67 экспрессирующих клеток оказались статистически значимыми (df = 6, р<0,05). Наибольшая разница была между с одновременно низкими и с одновременно высокими концентрациями E2 и Pg (p<0,001).

В объединенной подгруппе больных с одновременно низкими концентрациями E2 и Pg или одного из них (позиция 3.5) удельный вес больных РМЖ с низким содержанием в опухоли Ki-67 положительных клеток также был выше (42,9%), а с высокими – ниже (28,1%), чем в подгруппе с одновременно высокими концентрациями этих гормонов (р = 0,006).

У больных РМЖ на II–IV стадиях искомые взаимосвязи Ki-67 с E2 отсутствовали (позиции 1.1 и 1.2, р = 0,5), а с Pg были такими же, как выше описанные у больных с I стадией, но статистически слабо значимыми (р = 0,04). Только при сопоставлении больных с одновременно высокими концентрациями E2 и Pg (позиция 3.4) с объединённой подгруппой больных с их одновременно и по-отдельности низкими концентрациями (позиция 5) выявлены такие же различия, как и у больных с I стадией РМЖ, но значительно статистически слабее (р = 0,03).

Выраженное снижение удельного веса больных с малым удельным весом Ki-67 положительных клеток (≤14) и соответствующее повышение с большим (>30) при II–IV стадиях по сравнению с I стадией имело место как при низких, так и при высоких концентрациях E2 и Pg по-отдельности и в каждой из 4 комбинаций (р<0,01).

Таким образом, высокая пролиферативная активность опухоли была ассоциирована с одновременно высокими концентрациями E2 и Pg в сыворотке крови больных РМЖ. Эти взаимосвязи оказались характерными для больных с I стадией РМЖ и в меньшей степени для II–IV стадий. Возрастание удельного веса активно пролиферирующих опухолей у больных со II–IV стадиями РМЖ по сравнению с I стадией наблюдалось независимо от содержания в сыворотке E2 и Pg.

Результаты аналогичного исследования взаимосвязей экспрессии Ki-67 в опухоли и уровней антиидиотипических антител к E2 и Pg в сыворотке крови представлены в таблице 3. У больных с I стадией РМЖ искомые взаимосвязи не обнаружены.

 

Таблица 3. Число (n) и удельный вес (%) больных раком молочной железы (РМЖ) с различным содержанием в опухоли Ki-67 экспрессирующих клеток в зависимости от уровней антиидиотипических антител к эстрадиолу и прогестерону (IgG₂-E2 и IgG₂-Pg, у.е.)

Table 3. Numbers (n) and prevalence (%) of breast cancer patients (BCP) with different levels of tumor Ki-67 expressing cells according to serum levels of antiidiotypic antibodies to estradiol and progesterone (IgG₂-E2 и IgG₂-Pg, CU)

Антитела и их комбинации Antibodies and their combinations	РМЖ I стадия I stage BCP (N = 430)			РМЖ II-IV стадии II-IV stages BCP (N = 477)			χ2 (p) df = 2
	Ki-67 ≤14	Ki-67 15-30	Ki-67 >30	Ki-67 ≤14	Ki-67 15-30	Ki-67 >30
	n/%	n/%	n/%	n/%	n/%	n/%
1.1. IgG2-E2≤3,5 1.2. IgG2-E2>3,5	66/43,4 101/36,3	42/27,6 84/30,2	44/28,9 93/33,5	33/17,3 77/26,9	40/20,9 65/22,7	118/61,8 144/50,3	40,9 (<0,001) 16,5 (<0,001)
χ2(р), df = 2	2,1 (0,35)			7,5 (0,02)
2.1. IgG2-Pg ≤2,5 2.2. IgG2-Pg>2,5	86/39,3 81/38,4	62/28,3 64/30,3	71/32,4 66/31,3	41/18,1 69/27,6	47/20,7 58/23,2	139/61,2 123/49,2	39,9 (<0,001) 15,3 (<0,001)
χ2(р), df = 2	0,2 (0,90)			8,2 (0,02)
3.1. IgG2-E2≤3,5      +IgG2-Pg≤2,5	41/42,7	27/28,1	28/29,2	17/16,2	20/19,0	68/64,8	27,3 (<0,001)
3.2. IgG2-E2>3,5      +IgG2-Pg≤2,5	45/36,6	35/28,5	43/35,0	24/19,7	27/22,1	71/58,2	14,3 (<0,001)
3.3. IgG2-E2≤3,5      +IgG2-Pg>2,5	25/44,6	15/26,8	16/28,6	16/18,6	20/23,3	50/58,1	14,5 (<0,001)
3.4. IgG2-E2>3,5      +IgG2-Pg>2,5	56/36,1	49/31,6	50/32,3	53/32,3	38/23,2	73/44,5	5,5 (0,06)
3.5. (3.1+3.2+3.3)	111/40,4	77/28,0	87/31,6	57/18,2	67/21,4	189/60,4	53,5 (<0,001)
χ2 (р), df = 6	2,6 (>0,05)			15,7 (<0,05)
χ2 (р3.1-3.4), df = 2	1,1 (0,58)			11,9 (0,003)
χ2 (р3.5-3.4), df = 2	0,9 (0,64)			14,4 (<0,001)

 

У больных со II–IV стадиями РМЖ опухоли с низким содержанием Ki-67 ≤14 позитивных клеток встречались чаще при высоких уровнях IgG₂-E2 и IgG₂-Pg (позиции 1.2 и 2.2), чем при низких (позиции 1.1 и 2.1). Соответственно, опухоли с высоким содержанием Ki-67>30 обнаруживались реже (р = 0,02).

Анализ искомых взаимосвязей с комбинациями высоких и низких уровней исследуемых антител показал следующее. При одновременно низких уровнях IgG₂-E2 и IgG₂-Pg (позиция 3.1) или одного из них (позиции 3.1 и 3.2) опухоли с низким содержанием Ki-67 положительных клеток (≤14) встречались в 16,2-19,7%, а с высоким (>30) – в 58,1-64,8%. В отличие от этого, при одновременно высоких уровнях IgG₂-E2 и IgG₂-Pg (позиция 3.4) опухоли с Ki-67 ≤14 обнаруживались чаще (32,3%), а опухоли с Ki-67>30 реже (44,5%, р<0,05). Наиболее значимые различия выявлены между подгруппами с одновременно низкими и одновременно высокими уровнями IgG₂-E2 и IgG₂-Pg (р = 0,003). Небольшая разница в показателях по позициям 3.1; 3.2 и 3.3 позволило объединить их в отдельную подгруппу 3.5. Различия между подгруппами 3.5 и 3.4 тоже были статистически значимыми (р<0,001).

Возрастание удельного веса активно пролиферирующих опухолей (Ki-67>30) у больных со II–IV стадиями РМЖ по сравнению с I стадией имело место как при низких, так и при высоких уровнях IgG₂-E2 и IgG₂-Pg (позиции 1 и 2), а также при одновременно низких уровнях или низком уровне одного из них (позиции 3.1, 3.2 и 3.3, р<0,001). Таковое возрастание у больных с одновременно высокими уровнями исследуемых антител (позиция 3.4) было незначительным (р = 0,06).

Таким образом, одновременное повышение уровней антиидиотипических антител, специфичных к E2 и Pg, подавляло пролиферативную активность опухолей у больных со II–IV стадиями РМЖ и её возрастание по сравнению с I стадией заболевания.

Исследование кооперативного участия половых стероидных гормонов и гормон-специфических антиидиотипических антител в регуляции пролиферативной активности опухоли у больных РМЖ показало следующее (табл. 4).

Таблица 4. Число (n) и удельный вес (%) больных раком молочной железы (РМЖ) с низким (≤30) и высоким (>30) содержанием в опухоли Ki-67 экспрессирующих клеток в зависимости от концентрации (pmol/L) в сыворотке эстрадиола и прогестерона (E2 и Pg) в кооперации с комбинациями уровней  антиидиотипических антител к эстрадиолу и прогестерону (IgG₂-E2 и IgG₂-Pg, у.е.)

Table 4. Numbers (n) and prevalence (%) of breast cancer patients (BCP) with low (≤30) and high (>30) levels of tumor Ki-67 expressing cells according to estradiol and progesterone (E2 and Pg) serum concentration (pmol/L) in cooperation with combinations of antiidiotypic antibodies to estradiol and progesterone (IgG₂-E2 и IgG₂-Pg, CU)

Комбинации антител Antibodies combinations	РМЖ I стадия I stage BCP		РМЖ II–IV стадии II–IV stages BCP		РМЖ I стадия I stage BCP		РМЖ II–IV стадии II–IV stages BCP
	Ki-67 ≤30	Ki-67 >30	Ki-67 ≤30	Ki-67 >30	Ki-67 ≤30	Ki-67 >30	Ki-67 ≤30	Ki-67 >30
	n/%	n/%	n/%	n/%	n/%	n/%	n/%	n/%
	E2≤200				Pg≤600
1.1. IgG2-E2≤3,5      +IgG2-Pg≤2,5	39/76,5	12/23,5	26/45,6	** 31/54,4	27/81,6	6/18,2	13/36,1	** 23/63,4
1.2. IgG2-E2>3,5      +IgG2-Pg≤2,5	49/70,0	21/30,0	24/42,9	** 32/57,1	46/77,9	13/22,1	20/51,3	** 19/48,7
1.3. IgG2-E2≤3,5      +IgG2-Pg>2,5	28/68,3	13/31,7	17/36,9	** 29/63,1	23/92,0	2/8,0	18/45,0	** 22/55,0
1.4. IgG2-E2>3,5      +IgG2-Pg>2,5	66/72,5	25/27,5	47/55,3	* 38/44,7	46/67,6	22/32,4	39/62,9	23/37,1
1.5. (1.1+1.2+1.3)	116/71,6	46/28,4	67/42,1	** 92/57,9	96/82,1	21/17,9	51/44,3	** 64/55,7
χ2 (р1.5-1.4), df = 1	0,0 (0,99)		3,3 (0,07)		4,2 (0,04)		4,8 (0,03)
	E2>200				Pg>600
2.1. IgG2-E2≤3,5      +IgG2-Pg≤2,5	29/65,9	16/34,1	11/22,9	* 37/77,1	41/65,1	22/34,9	24/34,8	* 45/65,2
2.2. IgG2-E2>3,5      +IgG2-Pg≤2,5	31/58,5	22/41,5	27/40,9	39/59,1	34/53,1	30/46,9	31/37,3	52/62,7
2.3. IgG2-E2≤3,5      +IgG2-Pg>2,5	12/80,0	3/20,0	19/47,5	21/52,5	17/54,8	14/45,2	18/39,1	28/60,9
2.4. IgG2-E2>3,5      +IgG2-Pg>2,5	39/60,9	25/39,1	44/55,7	35/44,3	59/67,8	28/32,2	52/50,9	50/49,1
2.5. (2.1+2.2+2.3)	72/63,7	41/36,3	57/37,0	* 97/63,0	92/58,2	66/41,8	72/36,5	* 125/63,5
χ2 (р2.5-2.4), df = 1	0,04 (0,84)		6,7 (0,009)		1,8 (0,18)		5,2 (0,02)

Примечание: *– р<0,01; **– p<0,001

 

У больных с низкими концентрациями гормонов в сыворотке крови E2≤200 pmol/L или Pg≤600 pmol/L значительно возрастало число случаев с активно пролиферирующими опухолями (KI-67>30) при II–IV стадиях по сравнению с I стадией (более, чем на 25%), если уровни IgG₂-E2 и IgG₂-Pg были низкими, одновременно или каждого их них по-отдельности (позиции 1.1, 1.2 и 1.3; р<0,001). Такое же возрастание имело место в объединённой подгруппе 1,5 (р<0,001). Если уровни IgG₂-E2 и IgG₂-Pg были одновременно высокими (позиция 1.4), возрастание на 17,2% оказалось статистически значимым (р = 0,013) при E2≤200 и совсем незначительным (на 4,7%) при Pg≤600 (р = 0,57).

У больных с одновременно высокими концентрациями E2>200 pmol/L или Pg>600 pmol/L превышение удельного веса опухолей с высоким содержанием Ki-67 положительных клеток при II–IV стадиях по сравнению с I наблюдалось только в случаях с одновременно низкими уровнями исследуемых антиидиотипических антител (позиция 2.1; р<0,001). Если низким был уровень только одного из них (позиции 2.2 и 2.3) различия были статистически недостоверными (р>0,05). Однако в объединённой подгруппе 2.5 они достигали статистической значимости (р<0,01).

У больных с одновременно высокими уровнями IgG₂-E2 и IgG₂-Pg (позиция 2.4) и высокой концентрацией E2>200 pmol/L разница по удельному весу опухолей с Ki-67>30 составляла всего 5,2% (р = 0,53), а при высокой концентрации Pg>600 pmol/L –16,9% (р = 0,03).

У больных II–IV стадией РМЖ с одновременно высокими уровнями идиотипических антител (позиции 1.4 и 2.4) удельный вес опухолей с Ki-67>30 был ниже по сравнению с объединёнными подгруппами 1.5 и 2.5 в комбинации с: E2≤200 (р = 0,07); с Pg≤600 (р = 0,03); с E2>200 (р = 0,009); с Pg>600 (р = 0,02).

Таким образом, общей закономерностью полученного результата по таблице 4 являлось значительное превышение удельного веса активно пролиферирующих опухолей с высоким содержанием Ki-67 положительных клеток (>30) при одновременно низких уровнях IgG₂-E2 и IgG₂-Pg, независимое от концентрации E2 и Pg в сыворотке крови. Напротив, одновременное повышение уровней указанных антиидиотипических антител было ассоциировано со значительно меньшим удельным весом активно пролиферирующих опухолей, также проявляемым как при низких, так и при высоких концентрациях стероидных гормонов.

Исследовали взаимосвязи пролиферативной активности опухоли у больных РМЖ с одновременно низкими и высокими концентрациями гормонов в комбинации с одновременно низкими и высокими уровнями соответствующих антиидиотипических антител (табл. 5). Возрастание удельного веса опухолей с большим количеством Ki-67 положительных клеток (>30) на 36,0% у больных II–IV стадий по сравнению с I стадией имело место при одновременно низком содержании в сыворотке E2 и Pg в комбинации с одновременно низкими уровнями IgG₂-E2 и IgG₂-Pg (позиция 1; р = 0,03). Таковое возрастание было значительно меньше (на 9,9%, р = 0,48) в комбинации низких концентраций E2 и Pg с высокими уровнями IgG₂-E2 и IgG₂-Pg (позиция 2).

 

Таблица 5. Число (n) и удельный вес (%) больных раком молочной железы (РМЖ) с низким (≤30) и высоким (>30) содержанием в опухоли Ki-67 экспрессирующих клеток в зависимости от комбинаций низких (≤) и высоких (>) концентраций эстрадиола и прогестерона (E2 и Pg) в кооперации с комбинациями низких (≤) и высоких (>) уровней  антиидиотипических антител к эстрадиолу и прогестерону (IgG₂-E2 и IgG₂-Pg) в сыворотке крови

Table 5. Numbers (n) and prevalence (%) of breast cancer patients (BCP) with low (≤30) and high (>30) levels of tumor Ki-67 expressing cells according to combinations of low (≤) and high (>) estradiol and progesterone (E2 and Pg) concentrations and low (≤) and high (>) IgG₂-E2 и IgG₂-Pg serum levels

Комбинации гормонов и антител Hormones and antibodies combinations	РМЖ I стадия I stage BCP		РМЖ II–IV стадии II–IV stages BCP		χ2, (р) df = 1
	Ki-67 ≤30	Ki-67 >30	Ki-67 ≤30	Ki-67 >30
	n/%	n/%	n/%	n/%
1. [E2≤200+Pg≤600] +   [IgG2-Е2≤3,5+IgG2-Pg≤2,5]	18/81,8	4/18,2	11/45,8	13/54,2	4,9 (0,03)
2. [E2≤200+Pg≤600] +  [IgG2-E2>3,5+IgG2-Pg>2,5]	31/73,8	11/26,2	23/63,9	13/36,1	0,5 (0,48)
χ2, (р) df = 1	0,2 (0,68)		1,25 (0,26)
3. [E2>200+Pg>600] +  [IgG2-Е2≤3,5+IgG2-Pg≤2,5]	20/58,8	14/41,2	10/27,8	26/72,2	5,7 (0,02)
4. [E2>200+Pg>600] + [IgG2-E2>3,5+IgG2-Pg>2,5]	24/63,2	14/36,8	28/52,8	25/47,2	0,6 (0,44)
χ2, (р) df = 1	0,02 (0,89)		4,5 (0,03)

 

 

У больных с одновременно высоким содержанием E2 и Pg в комбинации с одновременно низкими уровнями IgG₂-E2 и IgG₂-Pg (позиция 3) разница по удельному весу опухолей с Ki-67>30 составляла 31,0% (р = 0,02), а в комбинации с одновременно высокими уровнями антител – 10,4% (р = 0,44).

У больных II–IV стадиями РМЖ удельный вес опухолей с Ki-67>30 был меньше на 18,1% при сравнении позиций 2 и 1 (р = 0,26), и на 25,0% (р = 0,03) при сравнении позиций 4 и 3.

Таким образом, одновременное повышение уровней IgG₂-E2 и IgG₂-Pg подавляло возрастание пролиферативной активности опухоли при её прогрессии как при низком, так и при высоком содержании в сыворотке E2 и Pg. Подавляющий эффект IgG₂-E2 и IgG₂-Pg был более выражен у больных с одновременно высокими концентрациями E2 и Pg.

Исследование взаимосвязей содержания в сыворотке стероидных гормонов и соответствующих антиидиотипических антител показало следующее (табл. 6). Положительные взаимосвязи обнаружены только между уровнями исследуемых антител у больных с I стадией РМЖ (р<0,001) и у больных со II–IV стадиями (р = 0,01), а также между концентрациями исследуемых гормонов (р = 0,02 и р<0,001, соответственно). Между уровнями IgG₂-E2 и IgG₂-Pg, с одной стороны, и содержанием E2 и Pg, с другой, искомые взаимосвязи отсутствовали.

 

Таблица 6. Взаимосвязи низких (≤) и высоких (>) уровней исследуемых антител и гормонов в сыворотке крови больных раком молочной железы (РМЖ)

Table 6. Correlations of low (≤) and high (>) studied antibodies and hormones serum levels in breast cancer patients (BCP)

Антитела, гормоны Antibodies, hormones	IgG2-Pg		E2		Pg
	≤2,5	>2,5	≤200	>200	≤600	>600
	n/%	n/%	n/%	n/%	n/%	n/%
РМЖ I стадия I stage BCP
1.1. IgG2-E2≤3,5 1.2. IgG2-E2>3,5	96/63,2 123/44,2	56/36,8 155/55,8	92/60,5 161/57,9	60/39,5 117/42,1	58/38,2 127/45,7	94/61,8 151/54,3
χ2, (р)	13,3 (<0,001)		0,2 (0,67)		1,9 (0,16)
2.1. IgG2-Pg≤2,5 2.2. IgG2-Pg>2,5	----	----	121/55,3 132/62,6	98/44,7 79/37,4	92/42,0 93/42,5	127/58,0 118/57,5
χ2, (р)	----		2,1 (0,15)		0,1 (0,74)
3.1. E2≤200 3.2. E2>200	----	----	----	----	121/47,8 64/36,2	132/52,2 113/63,8
χ2, (р)	----		----		5,3 (0,02)
РМЖ II–IV стадии II–IV stages BCP
4.1. IgG2-E2≤3,5 4.2. IgG2-E2>3,5	105/54,9 122/42,7	86/45,1 164/57,3	103/53,9 141/49,3	88/46,1 145/50,7	76/39,8 101/35,3	115/60,2 185/64,7
χ2, (р)	6,5 (0,01)		0,8 (0,37)		0,8 (0,37)
5.1. IgG2-Pg≤2,5 5.2. IgG2-Pg>2,5	----	----	113/49,8 131/52,4	114/50,2 119/47,6	75/33,0 102/40,8	152/67,0 148/59,2
χ2, (р)	----		0,2 (0,63)		2,7 (0,09)
6.1. E2≤200 6.2. E2>200	----	----	----	----	109/44,7 68/29,2	135/55,3 165/70,8
χ2, (р)	----		----		11,6 (<0,001)

 

Таким образом, исследуемые стероидные гормоны и антиидиотипические антитела проявляли себя как независимые сывороточные маркеры пролиферативной активности опухоли у больных РМЖ.

 

Обсуждение

Основываясь на известных данных о внегеномных биологических эффектах антител против стероидных рецепторов и стероидных гормонов, начали исследования влияния натуральных антиидиотипических антител, специфичных к E2 и Pg, в кооперации с E2 и Pg на возникновение и прогрессию РМЖ. Алгоритм настоящей работы включал в себя определение пограничных значений уровней IgG₂-E2 и IgG₂-Pg, E2 и Pg в сыворотке крови, по  которым больные РМЖ I стадии имели наибольшие различия по содержанию в опухоли минимального (<14%) и максимального (>30%) количества клеток, экспрессирующих маркер клеточной пролиферации протеин Ki-67. Затем анализировали ассоциации низких и высоких уровней исследуемых антител и гормонов с низким и высоким содержанием в опухоли Ki-67 положительных клеток в двух группах больных РМЖ с I и со II–IV стадиями, в том числе, сравнивая изменения клеточного состава опухоли по содержанию Ki-67  экспрессирующих клеток в зависимости от исходных уровней антител и гормонов в начале заболевания. Поскольку все пациентки в настоящем исследовании были с впервые установленным диагнозом РМЖ и не получали никакого предварительного специального противоопухолевого лечения, условно допускали, что выявленные различия между больными с I и со II–IV стадиями отражали искомые взаимосвязи индивидуальных иммунологических и эндокринных показателей с изменением пролиферативной активности опухоли в процессе её роста.

Активное участие E2 и Pg в канцерогенезе молочной железы, достаточно подробно изученное на молекулярном и клеточном уровнях [8, 23], проявилось в результате настоящей работы следующим образом. У больных РМЖ с I стадией опухоли с высоким содержанием Ki-67 экспрессирующих клеток обнаруживали чаще при высоких концентрациях в сыворотке E2 и Pg. Эти различия были особенно значительными при сравнении больных с одновременно низкими и одновременно высокими концентрациями гормонов. У больных II и IV стадией таковые различия были менее выражены. Таким образом, E2 и Pg проявляли синергическое стимулирующее воздействие на пролиферацию опухоли в основном в начале заболевания.

Противоположным эффектом обладали анти-идиотипические антитела к E2 и Pg.  У больных РМЖ II и IV стадией опухоли с высоким удельным весом Ki-67 положительных клеток выявлялись реже при высоких уровнях IgG₂-E2 и IgG₂-Pg, чем при низких. Одновременно высокие уровни IgG₂-E2 и IgG₂-Pg были ассоциированы с низким содержанием в опухоли Ki-67 экспрессирующих клеток, в то время как при одновременно низких уровнях этих антител или одного из них это содержание было высоким. У больных РМЖ I стадии подобные различия не обнаружены. Таким образом, IgG₂-E2 и IgG₂-Pg проявляли синергическое анти-пролиферативное воздействие при продолжающемся росте РМЖ.

Кроме того, противоположные эффекты стероидных гормонов и соответствующих антиидиотипических антител проявлялись в том, что значительное возрастание удельного веса опухолей с высоким содержанием Ki-67 положительных клеток у больных со II и IV стадиями РМЖ по сравнению с I стадией имело место как при низких, так и при высоких концентрациях E2 и Pg в сыворотке крови. Таковое возрастание было незначительным у больных с одновременно высокими уровнями IgG₂-E2 и IgG₂-Pg.

Особенно наглядно эти различия проявлялись при анализе влияния на пролиферацию опухоли гормонов в комбинации с исследуемыми антителами. Значительное возрастание содержания Ki-67 экспрессирующих клеток в опухоли со II–IV стадиями РМЖ наблюдалось при одновременно низких или одновременно высоких концентрациях E2 и Pg в комбинации с одновременно низкими уровнями IgG₂-E2 и IgG₂-Pg. Подобного возрастания не было у больных с одновременно высокими концентрациями E2 и Pg в комбинации с одновременно высокими уровнями IgG₂-E2 и IgG₂-Pg. То есть, одновременное повышение уровней IgG₂-E2 и IgG₂-Pg препятствовало возрастанию пролиферативной активности опухоли при её росте как при высоком содержании гормонов в сыворотке крови, так и при низком. Таким образом, широко распространённое представление о стимулирующем пролиферацию опухоли действии стероидных гормонов справедливо только для больных РМЖ с низкими уровнями соответствующих анти-идиотипических антител.

Полученные результаты о торможении пролиферативной активности опухоли антиидиотипическими антителами у больных РМЖ с высоким содержанием в сыворотке E2 соответствуют ранее полученным экспериментальным данным о блокировании E2- индуцированных реакций на клетки молочной железы in vitro антителами против ER [9, 10, 15].

В то же время, антиидиотипические моноклональные антитела к E2, способные распознавать ER, проявляли E2-специфическую активность на культивируемых остеобластах [21]. Более того, уровни анти-ERα натуральных антител в сыворотке больных РМЖ прямо коррелировали с количеством Ki-67 положительных клеток в опухоли, а выделенные из сыворотки анти-ERα антитела стимулировали пролиферацию культивируемых клеток РМЖ [14]. G. Leclercq [13] рассмотрел возможные молекулярные механизмы индукции E2-специфических реакций у опухолевых клеток молочной железы анти-ER антителами, в том числе анти-анти-E2 антителами. Последние, по его мнению, действуют как прямые агонисты E2, за счёт связывания с активирующими доменами мембранного ER. 

Однако, полученные нами результаты свидетельствуют о возможном прямом антагонистическом действии антител против стероидных рецепторов. В самом деле, IgG₂-E2 в комбинации с IgG₂-Pg угнетали пролиферацию опухоли у больных РМЖ даже при низких концентрациях E2 и Pg. Анализ молекулярных механизмов прямого анти-пролиферативного действия антиидиотипических антител, способных связываться с мембранными ER и PR, представляется нам весьма спекулятивным в настоящее время и требующим дополнительных исследований.

Тем не менее, вполне уместно рассмотреть перспективы практического применения иммуноанализа антиидиотипических антител к стероидным гормонам клинике РМЖ. Уровни IgG₂-E2 и IgG₂-Pg у больных с I стадией РМЖ, очевидно, являются более информативными предикторами повышения пролиферативной активности опухоли при её дальнейшем росте, чем концентрации Е2 и Pg. Таковое повышение имело место как при низком, так и при высоком содержании в сыворотке стероидных гормонов, каждого по-отдельности и в сочетаниях. Однако, пролиферативная активность возрастала только у больных с низкими уровнями IgG₂-E2 и/или IgG₂-Pg. У больных с одновременно высокими уровнями этих антител повышение пролиферации опухоли было незначительным.

В связи с этим, возникает вопрос, возможно ли использование аналогов натуральных IgG₂-E2 и/или IgG₂-Pg в качестве анти-пролиферативных средств у больных с их низким содержанием в сыворотке. Предполагается, что недостаточное количество аутологичных IgG₂-E2 и IgG₂-Pg будет компенсироваться их искусственными аналогами (соответствующими анти-идиотипическими антителами или антителами против стероидных рецепторов). Известным прототипом такого подхода является успешный опыт применения антител против рецептора эпидермального фактора роста в комбинированном лечении РМЖ.

 

Благодарность

Авторы благодарят академика Л.И. Иванову за поддержку выбранного направления исследований, а также сотрудников лаборатории иммунохимии Института экологии человека ФИЦ УУХ СО РАН Аносову Т.П., Аносова М.П., Гурова Е.А., за техническую поддержку настоящей работы.

Об авторах

Андрей Николаевич Глушков

Институт экологии человека ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр угля и углехимии Сибирского отделения Российской академии наук»

Email: glushkovan@ihe.sbras.ru
ORCID iD: 0000-0002-8560-6719
SPIN-код: 9536-8530
Scopus Author ID: 7006323832
ResearcherId: Q-5985-2016

доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории иммуногенетики

Россия, 650065, г. Кемерово, пр-т Ленинградский, 10, Россия

Елена Геннадьевна Поленок

Институт экологии человека ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр угля и углехимии Сибирского отделения Российской академии наук»

Email: egpolenok@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9368-2340
SPIN-код: 3925-0185
Scopus Author ID: 6506567994
ResearcherId: Q-5381-2016

кандидат фармацевтических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунохимии

Россия, 650065, г. Кемерово, проспект Ленинградский, 10

Людмила Александровна Гордеева

Институт экологии человека ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр угля и углехимии Сибирского отделения Российской академии наук»

Email: gorsib@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-5870-7584
SPIN-код: 6662-4616
Scopus Author ID: 14052058500
ResearcherId: R-2781-2016

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммуногенетики

Россия, 650065, г. Кемерово, пр-т Ленинградский, 10, Россия

Александр Витальевич Антонов

ГБУЗ «Кузбасский клинический онкологический диспансер имени М.С. Раппопорта»

Email: al0412@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0802-9759

заведующий отделением опухолей молочной железы 

Россия, 650036, г. Кемерово, ул. Волгоградская, 35, Россия

Павел Валерьевич Байрамов

ГБУЗ «Кузбасский клинический онкологический диспансер имени М.С. Раппопорта»

Email: bayramov_pavel82@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4649-5892

заведующий патологоанатомическим отделением

Россия, 650036, г. Кемерово, ул. Волгоградская, 35, Россия

Наталья Евгеньевна Вержбицкая

ГБУЗ «Кузбасский клинический онкологический диспансер имени М.С. Раппопорта»

Автор, ответственный за переписку.
Email: verzhbitskaia@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3860-825X

кандидат медицинских наук, врач-патологоанатом 

Россия, 650036, г. Кемерово, ул. Волгоградская, 35, Россия

Глеб Иванович Колпинский

ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный медицинский университет»; ГАУЗ «Клинический консультативно-диагностический центр им. И.А. Колпинского»

Email: Glebss@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5526-2687
SPIN-код: 6894-6419
Scopus Author ID: 56677706300

доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры лучевой диагностики и лучевой терапии с курсом онкологии 

Россия, 650066, г. Кемерово, пр. Октябрьский, 53/1, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы