Изменения экспрессии TLR2 и TLR4 при успешном и патологическом старении

Полный текст

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-15-00137, https://rscf.ru/project/23-15-00137/.

Введение

В настоящее время общепризнанной теорией старения является теория inflammaging – воспалительного старения. Ведущая роль в развитии воспалительного старения отводится механизмам врожденного иммунитета [7]. Ключевыми рецепторами врожденного иммунитета являются Toll-подобные рецепторы, распознающие широкий спектр экзогенных и эндогенных сигналов опасности. Активация TLR приводит к продукции провоспалительных и противовоспалительных медиаторов и обеспечивает реализацию эффекторных механизмов врожденной иммунной защиты [8]. С возрастом наблюдаются изменения в экспрессии Toll-рецепторов, а также в ассоциированных с ними сигнальных путях, следствием чего может быть изменение функции врожденных и адаптивных реакций иммунитета, приводящих к развитию возраст-ассоциированных воспалительных заболеваний и увеличению числа и тяжести инфекционных осложнений в старческом возрасте [9, 11, 12].

Закономерности возрастных изменений функционирования системы TLR остаются предметом изучения. Целью данной работы явилось исследование экспрессии рецепторов TLR2 и TLR4 в клетках периферической крови у долгожителей и лиц старческого возраста при различных фенотипах старения.

Материалы и методы

Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» и было одобрено локальным этическим комитетом при ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (заседание № 24 от 20.11.2023). Все пациенты, включенные в исследование, давали информированное согласие на участие, а также согласие на обработку персональных данных.

В исследование включались лица следующих возрастных групп:

1. группа долгожителей, n = 100 (средний возраст – 94 (90-97);
2. группа лиц старческого возраста, n = 49;
3. группа молодых доноров, составивших группу сравнения, n = 50.

Участники исследования проходили плановое стационарное лечение в ГБУЗ ГВВ № 2 ДЗ и ГБУ Геронтологический центр г. Москвы. У пациентов групп 1 и 2 проводились определение индекса коморбидности Чарльсон, оценка краткой батареи тестов физического функционирования (SPPB) и краткой шкалы оценки психического статуса (MMSE) [4, 6, 10]. На основании выбранных критериев группы 1 и 2 были разделены на 2 подгруппы в зависимости от фенотипа старения – патологическое старение и успешное старение.

1. Критерии включения в подгруппу патологического старения: индекс Чарльсон ≥ 3, индекс SPPB ≤ 7 баллов, MMSE ≤ 27.
2. Критерии включения в подгруппу успешного старения: индекс Чарльсон 1-2, индекс – SPPB > 7 баллов, MMSE > 27.

Определение экспрессии генов TLR2 и TLR4. Из клеток крови выделяли нуклеиновые кислоты («АмплиПрайм РНКСорб», Россия) и проводили реакцию обратной транскрипции («ОТ-1» ООО «НПФ Синтол», Россия) в соответствии с протоколом производителя. Анализ экспрессии генов TLR2 и TLR4 проводился методом ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Праймеры и реактивы для ПЦР реакции были синтезированы фирмой ООО «НПФ Синтол» (Россия). Экспрессию целевых генов нормализовали на ген домашнего хозяйства – β-актин, оценивали по методу ΔΔСt [2].

Определение экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхности клеток периферической крови осуществлялось с помощью проточной цитофлюориметрии по описанной ранее методике [3]. Клетки окрашивались моноклональными антителами (МАТ) против TLR2 (Alexa Fluor 488, e-Biosciences, США) и TLR4 (PE, AntibodySystem, Франция), а также МАТ против CD45 (PC5.5, Beckman Coulter, США) и CD14 (APC, Beckman Coulter, США) и оценивались на проточном цитометре (Navios Beckman Coulter, США). Исследуемые популяции клеток гейтировались по показателям светорассеяния, а также маркерам CD45 и CD14. Средняя интенсивность флюоресценции клеток (MFI) определялась как отношение средней интенсивности флюоресценции образца к средней интенсивности флюоресценции соответствующего изотипического контроля.

Статистическая обработка данных проведена с использованием программы GraphPad Prism 9.0.0. Данные были проверены на нормальность распределения, определены их дисперсии. Сравнение исследуемых групп проводили с использованием критерия Краскела–Уоллиса и апостериорным критерием Данна.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования были проанализированы уровни экспрессии генов и молекул TLR2 и TLR4 в клетках периферической крови молодых доноров, лиц старческого возраста и долгожителей (рис. 1).

 

Рисунок 1. А – экспрессия гена и белка TLR2. Б – экспрессия гена и белка TLR4 в лейкоцитах пациентов исследуемых групп

Примечание. На рисунках 1, 2, 3 представлены значения поверхностной экспрессии TLR2 и TLR4 в CD45⁺CD14⁺ клетках; данные представлены в виде Me (Q_0,25-Q_0,75); * – р < 0,05; ** – p < 0,01.

Figure 1. A, expression of the gene and protein TLR2. B, expression of the gene and protein TLR4 in leukocytes of patients in the study groups.

Note. Figures 1, 2, 3 show the surface expression values of TLR2 and TLR4 in CD45⁺CD14⁺ cells; data are presented as Me (Q_0.25-Q_0.75); *, p < 0.05; **, p < 0.01.

 

Показатели экспрессии гена TLR2 увеличивались как в группах старческого возраста, так и долгожителей, по сравнению с группой молодых доноров (p < 0,01). На моноцитах периферической крови поверхностная экспрессия молекулы TLR2 также была достоверно повышена (р < 0,05) относительно группы сравнения (рис. 1А). При этом анализ TLR4, напротив, выявил статистически значимое снижение показателей экспрессии гена и молекул (р < 0,05) как в группе старческого возраста, так и в группе долгожителей (рис. 1Б).

Дальнейший анализ уровней экспрессии TLR2 и TLR4 в зависимости от фенотипа старения позволил выявить различия между успешным и патологическим типами старения.

На рисунке 2 представлены уровни экспрессии гена и молекулы TLR2 в исследуемых группах в зависимости от фенотипа старения. У долгожителей с успешным фенотипом старения отмечаются наиболее высокие значения экспрессии TLR2 как на уровне гена, так и поверхностной экспрессии на CD14⁺ моноцитах (рис. 2А). В то время как в группе долгожителей с патологическим старением, напротив, наблюдалось снижение показателей экспрессии TLR2, до значений, сопоставимых с уровнем молодых лиц (рис. 2Б). При этом у пациентов старческого возраста при патологическом фенотипе старения наблюдалось увеличение экспрессии гена и поверхностной экспрессии TLR2 как в сравнении с молодыми донорами, так и в сравнении с аналогичной группой долгожителей (рис. 2Б). Успешный фенотип в старческом возрасте характеризовался более низкими показателями экспрессии TLR2, чем у долгожителей (рис. 2А).

 

Рисунок 2. А – экспрессия гена и белка TLR2 при успешном старении. Б – экспрессия гена и белка TLR2 при патологическом старении в лейкоцитах пациентов исследуемых групп

Примечание. Данные представлены в виде Me (Q_0,25-Q_0,75); * – статистически значимые отличия от группы молодых доноров; # – статистически значимые отличия группы долгожителей от лиц старческого возраста. * – р < 0,05; ** – p < 0,01; # – р < 0,05.

Figure 2. A, expression of the gene and protein TLR2 during successful aging. B, expression of the gene and protein TLR2 during pathological aging in leukocytes of patients in the study groups

Note. Data are presented as Me (Q_0.25-Q_0.75); *, statistically significant differences from the group of young donors; #, statistically significant differences between the group of centenarians and the elderly. *, p < 0.05; **, p < 0.01; #, p < 0.05.

 

Оценка экспрессии гена и белка TLR4 не выявила значимых различий в группе успешного фенотипа старения ни между лицами старческого возраста и долгожителями, ни между молодыми донорами (рис. 1А). При патологическом типе старения экспрессия гена TLR4 была снижена как у лиц старческого возраста, так и у долгожителей, в сравнении с молодыми донорами (рис. 3А). При этом в группе долгожителей с патологическим старением этот показатель был в 3 раза ниже, в сравнении с долгожителями с успешным типом (р < 0,01). При анализе уровней поверхностной экспрессии TLR4 на моноцитах наблюдалась тенденция по снижению в группах старческого возраста и долгожителей с обоими фенотипами старения (р < 0,1) (рис. 3А, Б).

 

Рисунок 3. А – экспрессия гена и белка TLR4 при успешном старении. Б – экспрессия гена и белка TLR4 при патологическом старении в лейкоцитах пациентов исследуемых групп

Примечание. Данные представлены в виде Me (Q_0,25-Q_0,75); * –р < 0,05; ** – p < 0,01.

Figure 3. A, expression of the TLR4 gene and protein during successful aging. B, expression of the TLR4 gene and protein during pathological aging in leukocytes of patients in the study groups

Note. Data are presented as Me (Q_0.25-Q_0.75); *, p < 0.05; **, p < 0.01.

 

Изучение возрастных изменений в системе распознавания врожденного иммунитета представляет собой крайне актуальную задачу, поскольку имеющиеся литературные данные о возрастных изменениях экспрессии TLR на клетках периферической крови крайне ограничены и неоднозначны [5, 13].

В настоящем исследовании впервые проведен анализ экспрессии генов и молекул TLR2 и TLR4 у лиц разных возрастных групп с учетом фенотипов старения: патологического и успешного. Данные поверхностной экспрессии были соотнесены с показателями экспрессии генов этих рецепторов, выявленные закономерности подтверждаются и имеют одинаковый характер изменений.

Нами показано, что в группах пациентов старческого возраста и долгожителей экспрессия TLR2 увеличена как на уровне гена, так и на поверхности клеток, по сравнению с молодыми донорами. При этом экспрессия TLR4, напротив, снижалась с возрастом.

Старческий возраст является критическим этапом, формирующим дальнейшее протекание процессов старения и окончательный переход к здоровому или патологическому долголетию, поскольку в этот период наиболее часто происходит проявление возраст-ассоциированных заболеваний. Полученные данные показывают, что при патологическом старении у лиц старческого возраста наблюдается самый высокий уровень экспрессии TLR2 среди обследованных групп, в то время как экспрессия TLR4 снижена. В исследовании на животных получены сходные результаты, экспрессия TLR4 на моноцитах старых мышей снижена по сравнению с молодыми животными, в то время как экспрессия TLR2 повышена [14]. Рецептор TLR2 образует гетеродимеры с TLR1, TLR4, TLR6 и TLR10, что обусловливает широкий спектр связываемых им эндогенных и экзогенных лигандов, концентрация которых возрастает в организме с возрастом. Таким образом, значительное повышение экспрессии TLR2 на системном уровне в старческом возрасте может выступать в качестве неблагоприятного прогностического признака развития патологического фенотипа старения. Успешное старение в этой возрастной группе в меньшей степени сопровождается повышением экспрессии TLR2, а экспрессия TLR4 остается на уровне молодых лиц.

У лиц старческого возраста и долгожителей с патологическим фенотипом старения изменения в экспрессии TLR2 имеют разнонаправленный характер. Долгожители представляют особую группу лиц, успешно перешедших 90-летний рубеж, несмотря на наличие ряда сопутствующих патологий. Согласно социодемографическим данным, в категорию долгожителей попадает менее 1% населения России [1]. В группе долгожителей с патологическим фенотипом старения наблюдалось снижение как TLR2, так и TLR4, по сравнению с молодыми лицами, что может свидетельствовать о дефекте системы распознавания врожденного иммунитета. У долгожителей с успешным старением выявлено повышение экспрессии TLR2 и сопоставимая с группой молодых лиц экспрессия TLR4. Это говорит о сохранности либо о повышении функции системы TLR в данной возрастной группе, что может быть значимым маркером успешного долголетия.

Заключение

Таким образом, выявляемые изменения в экспрессии TLR2 и TLR4, наблюдающиеся в разных возрастных группах, могут рассматриваться как маркеры различных фенотипов старения.

Об авторах

Е. М. Хасанова

ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения РФ

Автор, ответственный за переписку.
Email: joimolino@gmail.com

ассистент кафедры иммунологии медико-биологического факультета 

Россия, Москва

В. В. Греченко

ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения РФ

Email: joimolino@gmail.com

к.м.н., доцент кафедры иммунологии медико-биологического факультета 

Россия, Москва

Т. В. Громова

ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения РФ

Email: joimolino@gmail.com

к.м.н., доцент кафедры иммунологии медико-биологического факультета 

Россия, Москва

С. А. Сходова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт имени И.И. Мечникова»

Email: joimolino@gmail.com

к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории механизмов регуляции иммунитета 

Россия, Москва

Л. В. Ганковская

ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения РФ

Email: joimolino@gmail.com

д.м.н., профессор кафедры иммунологии медико-биологического факультета 

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы