Пациенты с коронарным атеросклерозом имели измененное соотношение субпопуляций моноцитов в крови, которое было связано с воспалительной реакцией клеток

Полный текст

Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда № 22-15-00273.

Введение

Моноциты являются ключевыми клетками врожденного иммунитета. Известны три основные субпопуляции циркулирующих моноцитов крови: классические CD14⁺⁺CD16^- (~80%), промежуточные CD14⁺CD16⁺ (~ 5%) и неклассические CD14⁺CD16⁺⁺ (~15%) [5]. Считается, что каждая из субпопуляций моноцитов выполняет разные функции [1, 2]. Есть исследования, которые демонстрируют, что классические моноциты отвечают в большей степени на бактериальное присутствие, тогда как неклассические – на вирусное [1]. Однако функции субпопуляций моноцитов до конца не изучены. Ранее мы продемонстрировали, что циркулирующие моноциты крови пациентов с атеросклерозом имели повышенную провоспалительную активность [3]. Мы решили выяснить, как связано соотношение субпопуляций моноцитов в крови и воспалительная реакция клеток при атеросклерозе. Целью нашей работы стало исследовать связь воспалительного ответа первичных моноцитов с распределением субпопуляций моноцитов относительно общего пула моноцитов у здоровых и больных CAD.

Материалы и методы

В исследование было включено 20 мужчин в возрасте от 46 до 70 лет, 10 из них без коронарного атеросклероза (CAD) и 10 пациентов с CAD. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией, все пациенты предоставили письменное информированное согласие. Пациенты были приняты в кардиохирургическое отделение МОНИКИ имени М.Ф. Владимирского. Была произведена коронарография по результатам которой пациенты были разделены на больных коронарным атеросклерозом с выявленным стенозом в 2 и более артериях (CAD) и здоровых без стеноза в артериях. Далее производился забор крови для изучения циркулирующих моноцитов. Лейкоцитарную фракцию получали путем наслаивания на фикол и центрифугирования. Затем выделяли первичные моноциты с помощью магнитной сепарации положительной по CD14⁺. Субпопуляции моноцитов были выявлены при помощи проточной цитометрии (производитель Beckman Coulter, США) из лейкоцитарной фракции с использованием антител против CD14-FITC и CD16-PB450-A (производитель Miltenyi Biotic, Германия). Первичные моноциты культивировали в 48-луночном культуральном планшете (производитель SPL Lifesciences, Южная Корея) в среде X-VIVO 10 (производитель Lonza Bioscience, США) сразу после выделения стимулировали LPS с конечной концентрацией 1 мкг/мл, через 24 часа отбирали супернатант для дальнейшего иммуноферментного анализа. Воспалительный ответ оценивали по секреции цитокинов TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, CCL2 с помощью ELISA (производитель R&D Systems, США).

Результаты и обсуждение

Оказалось, что моноциты пациентов с CAD секретировали повышенный уровень IL-1β и TNF, но пониженный уровень CCL2 и IL-6 при стимуляции LPS по сравнению пациентов без CAD (рис. 1).

 

Рисунок 1. Секреция цитокинов стимулированными LPS первичными моноцитами пациентов с CAD

Примечание. Представлен воспалительный ответ первичных моноцитов по цитокинам TNF, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, CCL2 после стимуляции LPS (1 мкг/мл) через 24 часа. По оси X – моноциты с базальной (K) и стимулированной липополисаххаридом (LPS) секрецией от здоровых и больных CAD соответственно. По оси Y – уровень секреции соответсвующих цитокинов в пг/мл. * – по критерию Стьюдента p < 0,05, ** – p < 0,01.

Figure 1. Cytokine secretion by LPS-stimulated primary monocytes from CAD patients

Note. The inflammatory response of primary monocytes according to the cytokines TNF, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, CCL2 after stimulation with LPS (1 μg/mL) after 24 hours is presented. X-axis shows monocytes with basal (K) and lipopolysaccharide (LPS)-stimulated secretion from healthy and CAD patients, respectively. The Y axis is the level of secretion of the corresponding cytokines in pg/mL. *, by Student’s t-test p < 0.05; **, p < 0.01.

 

У пациентов с CAD наблюдалось повышенное содержание промежуточных и неклассических субпопуляций моноцитов, и сниженное количество классических моноцитов по сравнению пациентами без CAD (рис. 2А).

 

Рисунок 2. Взаимосвязь субпопуляций и воспалительного ответа первичных моноцитов у пациентов с CAD

Примечание. A – процентное соотношение субпопуляций от общего моноцитарного пула у пациентов с CAD и без соответственно. По оси X – субпопуляции моноцитов (классические CD14⁺⁺CD16^-, промежуточные CD14⁺CD16⁺ и неклассические CD14⁺CD16⁺⁺). По оси Y – процент субпопуляций от общего моноцитарного пула. ** – по критерию Стьюдента p < 0,01. Б – взаимосвязь субпопуляций моноцитов с воспалительным ответом пациентов с CAD и без соответственно. По оси X – процент промежуточных CD14⁺CD16⁺ и неклассических CD14⁺CD16⁺⁺ субпопуляций моноцитов от общего моноцитарного пула. По оси Y – уровень секреции цитокина IL-1β и хемокина CCL2 после стимуляции LPS (1 мкг/мл) в пг/мл. По критерию Пирсона на уровне p < 0,05.

Figure 2. Relationship between subpopulations and the inflammatory response of primary monocytes in patients with CAD

Note. A, percentage of subpopulations of the total monocytic pool in patients with and without CAD, respectively. Along the X axis are monocyte subpopulations (classical CD14⁺⁺CD16^-, intermediate CD14⁺CD16⁺ and non-classical CD14⁺CD16⁺⁺). The Y axis is the percentage of subpopulations from the total monocytic pool. **, Student’s t-test p < 0.01. B, relationship of monocyte subpopulations with the inflammatory response of patients with and without CAD, respectively. The X axis is the percentage of intermediate CD14⁺CD16⁺ and non-classical CD14⁺CD16⁺⁺ subpopulations of monocytes from the total monocytic pool. The Y axis shows the level of secretion of the cytokine IL-1β and chemokine CCL2 after stimulation with LPS (1 μg/mL) in pg/mL. By Pearson t-test at p < 0.05 level.

 

Также у пациентов с CAD наблюдалась прямая корреляция как между неклассической, так и промежуточной субпопуляцией моноцитов и секрецией IL-1β, и обратная с секрецией IL-10 и CCL2 после стимуляции LPS. Так как базальная секреция цитокинов была на уровне чувствительности метода, то различия в таких значениях не приводили (рис. 2Б).

Таким образом, наблюдаемое повышение количества промежуточных и неклассических моноцитов у пациентов с CAD было связано с изменениями в восплаительном ответе клеток по секреции цитокинов IL-1β и CCL2. При этом изменения в секреции TNF и IL-6 моноцитами пациентов с CAD не были связаны с субпопуляциями клеток.

Заключение

Моноциты пациентов с CAD обладали измененной воспалительной реакцией в ответ на стимуляцию LPS по сравнению с пациентами без CAD. Это проявлялось в повышенной секреции IL-1β и TNF, и пониженной секрецией CCL2 и IL-6. Повышение количества промежуточных и неклассических моноцитов у пациентов с CAD было связано с изменениями в воспалительном ответе клеток по секреции цитокинов IL-1β и CCL2. Можно предположить, что патологические изменения в представленности субпопуляций моноцитов в кровотоке может быть одной из причин хронизации воспаления в стенках артерий, способствуя прогрессии атеросклеротических поражений.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Центру высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ИБГ РАН за возможность использования научного оборудования.

Об авторах

С. С. Верхова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»; ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского»

Автор, ответственный за переписку.
Email: verxova.svetlana@gmail.com

аспирант Научно-исследовательский институт морфологии человека имени академика А.П. Авцына ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского»; старший лаборант лаборатории Ангиопатологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»

Россия, Москва; Москва

Н. Г. Никифоров

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»; ФГБУН «Институт биологии гена» Российской академии наук

Email: verxova.svetlana@gmail.com

к.б.н., научный сотрудник лаборатории ангиопатологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»; младший научный сотрудник, Центр коллективного пользования и Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ФГБУН «Институт биологии гена» Российской академии наук

Россия, Москва; Москва

Е. С. Чегодаев

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»; ФГБУН «Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта» Российской академии наук

Email: verxova.svetlana@gmail.com

аспирант ФГБУН «Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта» Российской академии наук; старший лаборант лаборатории ангиопатологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»

Россия, Москва; Москва

М. А. Попов

ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского»

Email: verxova.svetlana@gmail.com

к.м.н., научный сотрудник кардиохирургического отделения 

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы