ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ НА ШИГА-ТОКСИН 2 (STX2) У ДЕТЕЙ БОЛЬНЫХ ЭШЕРИХИОЗОМ С ГЕМОЛИТИКО-УРЕМИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ

Полный текст

Введение

Прогрессирование кишечной инфекции, вызванной продуцирующими шига-токсин штаммами Escherichia coli (STEC) ‑ эшерихиоза, может приводить к тяжёлым для жизни осложнениям, таким как гемолитико-уремический синдром (ГУС), который представляет собой тромботическую микроангиопатию, характеризующуюся острой почечной недостаточностью, тромбоцитопенией и гемолитической анемией [4].

Во всем мире на долю STEC-инфекций ежегодно приходится 2,8 миллиона острых заболеваний, из которых 3890 случаев сопровождается развитием ГУС [6, 8, 10]. Ассоциированный со STEC-штаммами ГУС составляет до 90% случаев ГУС у детей и является самой частой причиной острой почечной недостаточности в детском возрасте. В России вспышки STEC-ГУС и спорадические случаи регистрируются в Московском, Поволжском регионах, Омске, Иваново, Оренбурге. Наиболее часто встречающимся серотипом, вызывающим серьезные вспышки и спорадические случаи типичного ГУС, является штамм E. coli O157:H7 (реже O111, O103, 0121 и др.) [3].

Патогенность STEC-штаммов обусловлена продукцией шига-токсинов (Stx), вызывающих гибель клеток вследствие инактивации рибосом и прекращения синтеза белка. Семейство Stx включает два типа белков (Stx1 и Stx2) [8]. Известно, что при заболеваниях, вызванных штаммами, продуцирующими Stx2, ГУС развивается в 6,8 раз чаще, чем при инфекциях, вызванных штаммами, продуцирующими Stx1 или одновременно Stx1 и Stx2 [3]. Данные белки имеют структуру АВ₅ и состоят из одной ферментативно-активной субъединицы A (32 кДа), связанной с пентамером субъединиц B (8 кДа). Шига-токсины вырабатываются во время колонизации бактериями E. coli слизистой оболочки кишечника, где проникают в кровоток [11]. Защитный иммунитет к инфекции STEC, вероятно, обеспечивается антителами, которые ингибируют колонизацию кишечника, и антителами, которые нейтрализуют Stx [9].

«Золотым» стандартом диагностики энтерогеморрагического эшерихиоза является микробиологический высев чистой культуры шига-токсин продуцирующего штамма E. coli. Однако в связи с широким использованием антибиотиков, а также с поздним поступлением в ряде случаев больного в стационар это не всегда осуществимо. Еще одним подходом к диагностике является использование метода амплификации нуклеиновых кислот для выявления генетических маркеров энтерогеморрагических E. coli (EHEC) ‑ O157, stx1, stx2, eae. В результате STEC-инфекции в организме формируются антитела, которые можно выявить в ИФА или иммуноблоте.

Цель настоящего исследования – провести микробиологические, иммунологические исследования и ПЦР-анализ клинического материала, выделенного от больных детей с ГУС, развившемся на фоне острой кишечной инфекции (ОКИ), для обнаружения шига-токсин продуцирующего штамма Escherichia coli, антител к Stx2 и/или генов stx2.

 

Материалы и методы

Исследуемые образцы. Клинический материал был получен от 30 пациентов в возрасте от 8 месяцев до 5 лет с типичными симптомами ГУС, в острой фазе кишечной инфекции. У всех пациентов ГУС развился после гастроэнтерита с продромальным периодом диареи в среднем 7,5 дней. Образцы клинического материала (фекалии, сыворотка крови) были получены в педиатрическом отделении интенсивной терапии города Москвы (ГБУЗ «Детская городская клиническая больница святого Владимира») в 2023 году. В качестве контроля использовали образцы сыворотки 20 здоровых доноров без признаков инфекционного заболевания или симптомов желудочно-кишечных расстройств, по крайней мере, в течение предшествующих 30 дней. До проведения экспериментов образцы сохранялись в условиях низкотемпературной заморозки (–68-70°С). Родители дали информированное согласие на участие своих детей в исследовании.

Рекомбинантные субъединицы А и В шига-токсина 2 типа (Stx2А и Stx2В) были получены ранее в нашей лаборатории [2].

Иммуноблоттинг. Для постановки иммуноблоттинга (ИБ) проводили электрофорез рекомбинантных субъединиц шига-токсина 2 типа в 15% полиакриламидном геле по методу Леммли, на дорожку вносили 3 мкг/лунку каждого белка в невосстанавливающих условиях. Переносили гель на нитроцеллюлозную мембрану с помощью полуэлектридной ячейки для переноса TransBlot SD SemiDry (Bio-Rad) по стандартному протоколу. После блокировки мембран в 1% молоке, инкубировали их с сываротками в разведении 1:200 в течение 2 ч. В качестве положительного контроля использовали ПАТ против А- и В-субъединицы шига-токина 2 типа; отрицательным контролем выступала сыворотка здорового человека. Второе антитело для детекции поликлональных антител было козьим анти-мышиным, связанным с пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich, США), и использовалось в разведении 1:5000, во всех остальных случаях – козьим против гамма-цепи иммоноглобулина G человека, связанным с пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich, США), и использовалось в разведении 1:5000. Для визуализации использовали в качестве субстрата 3,3-диаминобензидин тетрагидрохлорид (ДАБ, Sigma).

Иммуноферментный анализ. Для тестирования использовали 96-луночные планшеты (Costar, USA), сенсибилизированные рекомбинантными белками Stx2A и Stx2B в концентрации 10 мкг/мл. Для анализа использовали двукратные разведения образцов сыворотки в диапазоне от 1:20 до 1:2560. В качестве отрицательного контроля были взяты сыворотки крови здоровых доноров. В рабочем разведении применяли конъюгат человеческих иммуноглобулинов с пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich, США). Реакцию проявляли раствором субстрата – 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB, Sigma). Оптическую плотность измеряли на фотометре Multiskan (Labsistems, США) при длине волны 450 нм (ОП 450). Каждый образец сыворотки тестировали минимум дважды и определяли среднюю ОП.

Микробиологический анализ. Бактериологическое исследование образцов проводили с использованием среды обогащения (бульон, Мак-Конки) с последующим высевом на содержащие сорбитол среды.

ПЦР-анализ. Идентификацию генов stx2 осуществляли в соответствии с методиками референс-лаборатории Европейского Союза (EU-RL VTEC_Method_02_Rev 0 и EU-RL VTEC_Method_006_Rev 1, EU Reference Laboratory VTEC, Rome, Italy).

Статистический анализ. В ходе обработки результатов, полученных методом ИФА, определяли пороговое значение для данных с учетом максимальной чувствительности и специфичности, а также с использованием кривой рабочей характеристики приемника (ROC).

 

Результаты и обсуждение

ПЦР-анализ испражнений, выделенных у детей с типичными симптомами ГУС, в острой фазе кишечной инфекции, позволил выявить гены stx2 в 23,3% случаев. Бактериологические исследования позволили высеять чистую культуру E. coli O157:H7 только в 1 образце (3,3%). Данные результаты могут быть обусловлены, прежде всего, активной антибиотикотерапией, приводящей к быстрому уничтожению патогенна и выведению его из организма.

Результаты иммуноблота выявили наличие антител одновременно к обеим субъединицам шига-токина 2 в сыворотке крови у 66,7% пациентов с ГУС. Однако у 20% здоровых доноров также были выявлены антитела одновременно к обеим субъединицам шига-токина 2. В 100% случаев у больных были обнаружены антитела к субъединице А и у 50% здоровых доноров были обнаружены антитела к А-субъединице Stx2. Антитела, реагирующие только с субъединицей В (без наличия антител к А субъединице), не были обнаружены в сыворотках крови доноров. Репрезентативный ответ IgG на Stx2, обнаруженный с помощью ИБ в сыворотке пациентов с ГУС и доноров контрольной группы, показан на рисунке 1.

Шестнадцать пациентов с ГУС (53,3%), у которых по данным ИБ были обнаружены антитела к субъединицам A или AB, также были положительными в ИФА. У 7 здоровых доноров (35%), у которых по данным ИБ были выявлены IgG к субъединицам А или AВ Stx2, были положительными и по данным ИФА. Сравнение данных оптической плотности, полученных в результате ИФА с сыворотками крови к Stx2А и Stx2В у пациентов с ГУС и здоровых доноров представлены на рисунке 2.

По данным ИФА у 60% пациентов с типичными симптомами ГУС, в острой фазе кишечной инфекции, были выявлены антитела к А-субъединице Stx2. Среди здоровых доноров антитела к Stx2 А-субъединице были обнаружены у 35% исследуемых, уровень оптической плотности не превышал значения 2,2. В группе больных показатели оптической плотности колебались в районе 2,3-3, т.е. титры антител к Stx2 А-субъединице были выше. В 43,3% случаев у больных в сыворотке крови были выявлены титры к субъединице В Stx2 и только в 10% - у здоровых доноров с низким уровнем оптической плотности детектировались антитела к субъединице В Stx2. Среднее значение ОП было в группе больных составило 1,80 для Stx2А и 1,51 –для Stx2В, в группе контроля 1,091 ‑ для Stx2А и 0,65 ‑ для Stx2В.

Наличие антител к Stx снижают риск ГУС. Подтверждением того, что эти антитела к Stx играют роль в защитном иммунитете, основано на экспериментальных и клинических данных [9]. Ряд исследований выявили увеличение вероятности обнаружения антител к Stx у людей старшего возраста, которые устойчивы к ГУС-индуцирующим эшерихиозам [5, 9]. Кроме того, иммунизация лабораторных животных субъединицей B Stx и слитыми белками индуцирует нейтрализующие антитела, которые защищают мышей от заражения E. coli O157:H7 или токсинов [7].

Несмотря на высокую частоту выявления антител IgG против Stx2 среди здоровых доноров в настоящем исследовании, мы заметили, что среднее значение оптической плотности, полученное с помощью ИФА, было выше у больных доноров. Наличие антител к Stx2 у некоторых здоровых доноров указывает на его недавний контакт с патогенными E. coli, но благодаря иммунологической памяти развития инфекционного процесса не произошло. Наличие антител IgG к Stx2, среди здоровых доноров может быть обусловлено предшествующей инфекцией других шигатоксин-продуцирующих патогенов [1]. Высокие титры антител (увеличение оптической плотности в ИФА) у больных отражают развитие инфекционного процесса и формирование защитного иммунного ответа.

Сравнение информативности ПЦР-анализа и бактериологического, а также иммунологических исследований представлены на рисунке 3.

Таким образом, мы провели микробиологические, иммунологические исследования и ПЦР-анализ клинического материала, выделенного от детей больных ОКИ с ГУС, для обнаружения шига-токсин продуцирующего штамма Escherichia coli, антител к Stx2 и/или генов stx2. В результате постановки ИБ и проведения ИФА были выявлены антитела IgG к Stx2 в сыворотках детей больных острой кишечной инфекцией с ГУС. В настоящем исследовании было показано, что у всех больных детей к 7-8 дню от начала заболевания выявлялись антитела IgG к субъединице А Stx2. Антитела сывороток пациентов с ГУС и доноров из контрольной группы реагировали преимущественно с субъединицей А Stx2. При этом было также обнаружено, что в сыворотке крови могут находиться антитела только к субъединице А Stx2 или к обеим субъединицам (А и В) Stx2 одновременно, но не было выявлено ни одной сыворотки в которой содержались бы только антитела к субъединице В Stx2. Это позволяет предположить более важную роль антител к субъединице А Stx2 в формировании протективного иммунитета против STEC-инфекций.

Между результатами ИБ и ИФА наблюдалась средняя корреляция (0,53) по шкале Чеддока. Иммуноблот является более чувствительной реакцией по сравнению с ИФА, однако наличие иммунной прослойки людей затрудняет постановку диагноза STEC-инфекции на основании данных ИБ.

ГУС формируется как осложнение острой кишечной инфекции и, как правило, к моменту поступления пациента в отделение интенсивной терапии уже ведется активное лечение антибиотиками. В связи с этим бактериологические высев из клинического материала для получения чистой культуры патогена малоэффективен. То же самое относится к эффективности применения ПЦР-анализа для подтверждения STEC-инфекции, который также на 7-8 день от начала проявления острого кишечного заболевания становится малоинформативным. Для подтверждения диагноза STEC-инфекции, важно проводить комплексный анализ, в том числе с использованием иммунологических методов, которые могут способствовать выявлению причины заболевания при отсутствии бактерий и/или генов патогенных микроорганизмов в клиническом материале.

 

Заключение

Представлены результаты исследования клинических образцов на наличие маркеров STEC-штаммов. Иммунологические анализы, направленные на выявление специфических антител к Stx2 являются высокоинформативными для подтверждения диагноза у пациентов с острой кишечной инфекцией на стадии развития ГУС. Иммуноблот-анализ характеризовался более высокой чувствительностью для выявления антител к Stx2, однако в связи с наличием иммунологической прослойки среди здоровых людей предпочтительно использовать ИФА-анализ. У здоровых доноров при наличии антител к Stx2 титр антител был достоверно ниже, чем у больных.

Лабораторное подтверждение диагноза STEC-инфекции затруднено при проведении микробиологических и молекулярно-генетических исследований, что подтверждается в данной работе. Расширить эффективность лабораторной диагностики может постановка ИФА, направленного на выявление антител к Stx2А.

 

Работа выполнена в рамках Отраслевой программы Роспотребнадзора.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Мария Андреевна Шкуратова

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

Автор, ответственный за переписку.
Email: shkuratova@obolensk.org
ORCID iD: 0000-0001-8021-8453
SPIN-код: 7112-9372

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии 

Россия, 142279, Московская обл., г.о. Серпухов, р.п. Оболенск, Территория «Квартал А», 24

Анна Евгеньевна Хлынцева

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

Email: khlyntseva_anna@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0052-2602
SPIN-код: 3279-6161

кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии 

Россия, 142279, Московская обл., г.о. Серпухов, р.п. Оболенск, Территория «Квартал А», 24

Ольга Валериевна Калмантаева

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

Email: kalmantaevaov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2838-6879
SPIN-код: 4657-5192

кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии 

Россия, 142279, Московская обл., г.о. Серпухов, р.п. Оболенск, Территория «Квартал А», 24

Николай Николаевич Карцев

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

Email: kartsev@obolensk.org
ORCID iD: 0000-0002-2006-9131
SPIN-код: 5463-3016

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории антимикробных препаратов отдела молекулярной микробиологии

Россия, 142279, Московская обл., г.о. Серпухов, р.п. Оболенск, Территория «Квартал А», 24

Александр Львович Музуров

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы «Детская городская клиническая больница святого Владимира Департамента здравоохранения города Москвы»


Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования "Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: al_muz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4131-9440
SPIN-код: 8489-9991

кандидат медицинских наук, заведующий отделением Центра гравитационной хирургии крови и гемодиализа

 

доцент кафедры анестезиологии, реаниматологии и токсикологии детского возраста 

Россия, 107014, г. Москва, ул. Рубцовско-Дворцовая, д. 1/3, корп. 1 125993, г. Москва ул. Баррикадная, д.2/1

Виктория Валерьевна Фирстова

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

Email: firstova@obolensk.org
ORCID iD: 0000-0002-9898-9894
SPIN-код: 9166-9151

доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии 

Россия, 142279, Московская обл., г.о. Серпухов, р.п. Оболенск, Территория «Квартал А», 24

Список литературы

Дополнительные файлы