Определение спектра эндемичных изоформ аллергена Bet v 1 на территории Республики Беларусь

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Береза повислая, занимающая область умеренного климата, чаще всего встречается на территории Северной Америки и Европы. Ежегодно в период с апреля по май наблюдается интенсивное пыление берез, которое очень часто является одной из главных причин весеннего поллиноза, негативно влияя на качество жизни многих людей. Пыльцевая аллергия (поллиноз) занимает одно из ведущих мест среди аллергических заболеваний. В Европейском регионе значимой является сенсибилизация к пыльце березы. Bet v 1 – главный аллерген пыльцы березы, ответственный за выработку специфических IgE у 95% пациентов, сенсибилизированных к пыльце березы. Bet v 1 принадлежит к классу белков PR-10, включающих в себя большую группу аэроаллергенов и распространенных пищевых аллергенов. В настоящее время в соответствии c номенклатурой аллергенов выделяют 27 вариантов (изоформ) белка Bet v 1, которые отличаются между собой чаще всего только несколькими аминокислотами.

Целью настоящего исследования являлось определение разнообразия генетических вариантов главного аллергена пыльцы березы Bet v 1 на территории Республики Беларусь.

Исследована пыльца березы повислой, собранная в весенний период. Получены рекомбинантные векторные конструкции, содержащие гены, кодирующие различные изоформы аллергена Bet v 1. Определена нуклеотидная последовательность клонированных фрагментов. Установлено, что в 3 сиквенсах присутствуют интронированные участки, прерывающие кодирующую часть гена. Еще в 2 последовательностях обнаружена укороченная рамка считывания.

Проведен анализ результатов исследования спектра изоформ белка Bet v 1. Полученные последовательности в той или иной степени соответствуют 11 генетическим вариантам изучаемого аллергена. Большая часть (86%) выявленных вариантов соответствует 7 изоформам 2 изоаллергенов, размещенных в базе данных аллергенных белков, среди которых превалируют Bet v 1.0101-подобные последовательности (42%); за ними следует группа, объединенная вариантом Bet v 1.0104 – 19%, третье место (11%) занимают Bet v 1.0102-подобные последовательности. Изоаллерген Bet v 1.02 представлен только одним вариантом – максимально сходным с изоформой Bet v 1.0204 – и составил минимальных 3% от общего количества сиквенсов. В пределах одного дерева определено 7 изоформ Bet v 1. Установлено, что преобладающей изоформой главного аллергена пыльцы березы Bet v 1 является Bet v 1.0101 (Bet v 1a, X15877.1).

Полный текст

Введение

Известно, что белки PR-10 кодируются небольшим числом генов, которые экспрессируются изначально в корнях и в ответ на различные стрессы и повреждения тканей индуцируются во всех частях растения. Гены, экспрессируемые в пыльце березы повислой, кодируют смесь изоформ Bet v 1 с различной IgE-реактивностью [5, 11, 13, 14]. В настоящее время вариабельные нуклеотидные последовательности Bet v 1 объединены подкомитетом по номенклатуре аллергенов ВОЗ и Международным союзом иммунологических обществ в отдельную базу данных. Что касается белка Bet v 1, то основным критерием включения новой нуклеотидной последовательности в базу служит подтвержденная экспрессия гена в пыльце березы повислой, как минимум на уровне мРНК. В соответствии с принципами, лежащими в основе формирования номенклатуры, аллергены с подобными биохимическими функциями, молекулярной массой и идентичностью последовательности более 67% относят к изоаллергенам. В базе данных в настоящий момент зарегистрировано три изоаллергена Bet v 1: Bet v 1.01, Bet v 1.02, Bet v 1.03. Сходные последовательности группируются как варианты (изоформы) изоаллергена, если они демонстрируют идентичность более 90%. Выделяют 27 изоформ аллергена Bet v 1, к которым относятся 32 последовательности из GenBank [1, 8].

По данным литературы, известно, что существуют значительные генетические различия между отдельными деревьями березы повислой, даже в пределах одной среды обитания. Относительное обилие определенных вариантов Bet v 1 будет влиять на аллергенность пыльцы [10].

Целью данного исследования являлось определение спектра изоформ главного аллергена пыльцы березы Bet v 1, встречающихся на территории Республики Беларусь (эндемичные изоформы).

Материалы и методы

Для исследования была использована пыльца берез (n = 90) (Betula pendula), кластеризованных по 9 группам в зависимости от места произрастания (населенному пункту), собранная в весенний период на территории шести областей Республики Беларусь.

Выделение суммарной РНК из образцов пыльцы осуществлялось методом, основанным на применении LiСl [3]. Синтез кДНК на матрице РНК осуществляли с помощью реакции обратной транскрипции с применением набора реагентов RevertAid First cDNA Synthesis Kit производства Thermo Scientific, США, согласно прилагаемой инструкции.

Получение амплификатов гена, кодирующего белок Веt v 1, выполнялось методом ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидных последовательностей, синтезированных ООО «АртБиоТех», Республика Беларусь: Bet v 1dH 5’ – CGCGAAGCTTATGGGTGTTTTCAATTACGA – 3’ (прямой), Bet v 1rX 5’ – GCGCCTCGAGGTTGTAGGCATCGGAGTG – 3’ (обратный). Состав реакционной смеси: по 15 пмоль праймеров (ООО «АртБиоТех», Республика Беларусь), 2,5 мкл 10× буфера, 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ дНТФ, 1 мкл кДНК, 1,25 ед. АртStart-полимеразы (ООО «АртБиоТех», Республика Беларусь), деионизованная вода до конечного объема 25 мкл. Режим амплификации: 95 °С – 2 мин; 95 °С – 45 с, 55 °С – 45 с, 72 °С – 45 c, количество циклов – 35; 72 °С – 10 мин.

Анализ фрагментов ДНК, полученных в результате проведения ПЦР, осуществляли методом электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле. Электрофорез вели в трис-боратном буфере, рН 8,0, в течение 45 мин. ДНК визуализировали с помощью окрашивания геля бромистым этидием с последующим просмотром в УФ.

Для клонирования очищенного ПЦР-фрагмента в полилинкер вектора pJET1.2/blunt (Thermo Scientific, США) по «тупым» концам был применен набор CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific, США) в соответствии с инструкцией производителя. Лигирование проводили в объеме 20 мкл. В качестве лигирующего фермента использовали T4 DNA Ligase (Thermo Scientific, США) согласно инструкции производителя.

Трансформацию бактериальных клеток Escherichia сoli XLBlue (recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [Fʹ proAB lacI qZΔM15 Tn10 (Tet r)]) лигазной смесью осуществляли методом теплового шока. Селекция трансформированных бактериальных клеток выполнялась на среде LB (Titan Biotech, Индия), содержащей 50 мкг/мл ампициллина.

Выделение плазмидной ДНК проводилось колоночным методом с использованием набора реагентов GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific, США) в соответствии с инструкцией производителя.

Специфичность клонированного фрагмента подтверждалась секвенированием по методу Сэнгера [9]. Постановка секвенирующей реакции осуществлялась с использованием набора Brilliant Dye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Scientific, США) в соответствии с инструкцией производителя. Разделение фрагментов ДНК, полученных в результате секвенирующей реакции, проводилось методом капиллярного электрофореза на генетическом анализаторе 3500xL Applied Biosystems. Последующая обработка полученных данных выполнялась при помощи программы Bioedit Sequence Alignment Editor version 7.2.5. Идентификация гомологичных генов Bet v 1 была реализована с помощью программы BLAST (basic local alignment search tool) с использованием известных последовательностей на уровне нуклеотидов и белков [2].

Результаты и обсуждение

В результате исследования получено 49 рекомбинантных плазмидных ДНК с клонированными генами, кодирующими единичные копии изоформ белка Bet v 1. Определено 49 нуклеотидных последовательностей, соответствующих 36 различным пептидам, которые в той или иной степени соотносятся с 11 вариантами аллергена Bet v 1. В пыльце одного дерева установленные последовательности кодировали белки, с разной степенью сходства (от 93% до 100%) соответствующие 7 изоформам главного аллергена пыльцы березы. Не все идентифицированные генетические варианты соотносились с изоаллергенами, размещенными в базе данных аллергенных белков. Часть из них проявила максимальное сходство с депонентами GenBank, которые не включены в перечень аллергенов. На диаграмме видно, что 14% установленных последовательностей максимально сходны с задепонированными только в GenBank. Большая часть (86%) выявленных вариантов соответствует 7 изоформам 2 изоаллергенов, размещенных в базе данных аллергенных белков, среди которых превалируют Bet v 1.0101-подобные последовательности (42%); за ними следует группа, объединенная вариантом Bet v 1.0104 – 19%, третье место (11%) занимают Bet v 1.0102-подобные последовательности. Изоаллерген Bet v 1.02 представлен только одним вариантом – максимально сходным с изоформой Bet v 1.0204 – и составил минимальных 3% от общего количества сиквенсов (рис. 1).

 

Рисунок 1. Структура спектра изоформ Bet v 1

Figure 1. Structure of the spectrum of Bet v 1 isoform

 

В процессе исследования были обнаружены две последовательности с укороченной открытой рамкой считывания. В первом случае длина составила 320 п.н. (106 аминокислот), во втором – 385 п.н. (128 аминокислот). Полученные сиквенсы имели наивысшую гомологию с вариантами Bet v 1.0101 и Bet v 1.0109 (Z80101.1). В трех сиквенсах были обнаружены и некодирующие участки – интроны, положение которых было практически идентичным во всех анализируемых последовательностях. В двух случаях некодирующие участки отсутствовали. Тем не менее результаты выравнивания с известными последовательностями GenBank показали практически полное соответствие кодирующих частей. Во всех остальных вариантах размеры интронов варьировали от 84 п.н. до 104 п.н. По данным литературы наличие интронных последовательностей может стимулировать инициацию транскрипции, повышать стабильность пре-мРНК в ядре или скорость экспорта мРНК в цитоплазму.

Заключение

Определен спектр изоформ Bet v 1 березы повислой, произрастающей на территории Республики Беларусь. Показано высокое генетическое разнообразие клонированных последовательностей. Несмотря на то, что все полученные варианты экспрессируются в виде РНК в пыльце, часть выявленных последовательностей (14%) не входит в состав базы данных аллергенов. Как и ожидалось, большинство полученных последовательностей (36,7%) идентичны или максимально подобны (от 97,5% до 99,4%) по аминокислотному составу аллергену Bet v 1.0101, что соответствует результатам исследований, проведенных в других европейских странах: Австрии, Швеции, Нидерландах [4, 6, 10, 12]. 29 сиквенсов (59,2%) с разной степенью сходства (от 93,1% до 100%) гомологичны еще 10 вариантам Bet v 1, часть из которых (n = 6) задепонирована в базе данных аллергенных белков. Укороченная рамка считывания была обнаружена в 2 случаях. Установлено, что в пыльце одного дерева экспрессируются белки, соответствующие 7 изоформам главного аллергена пыльцы березы.

Выявлены интронированные участки, прерывающие кодирующую часть гена в 3 сиквенсах, что по данным литературы может повышать стабильность пре-мРНК в ядре, скорость экспорта мРНК в цитоплазму, а также стимулировать инициацию транскрипции [7].

Последовательности с установленными аминокислотными заменами представлены в GenBank (коды доступа РР639721, PP663111 – РР6663140).

×

Об авторах

О. Ю. Пархомчук

Республиканский центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья

Автор, ответственный за переписку.
Email: olgaparhom4uk@mail.ru

научный сотрудник, аспирант лаборатории иммунологии и клеточной биотехнологии, Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии, эпидемиологии, вирусологии и микробиологии

Белоруссия, Минск

Е. Г. Фомина

Республиканский центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья

Email: olgaparhom4uk@mail.ru

д.б.н., заведующая лабораторией иммунологии и клеточной биотехнологии, Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии, эпидемиологии, вирусологии и микробиологии

Белоруссия, Минск

Е. Е. Григорьева

Республиканский центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья

Email: olgaparhom4uk@mail.ru

к.б.н., доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии и клеточной биотехнологии, Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии, эпидемиологии, вирусологии и микробиологии

Белоруссия, Минск

Список литературы

  1. Allergen Nomenclature. Available at: http://www.allergen.org/index.php (accessed 23 July 2024).
  2. Basic Local Alignment Search. Available at: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. (accessed 23 July 2024).
  3. Bijli K.M., Singh B.P., Sridhara S., Arora N. Isolation of total RNA from pollens. Prep. Biochem. Biotechnol., 2001, Vol. 31, no. 2, pp. 155-162.
  4. Erler A., Hawranek T., Krückemeier L., Asam C., Egger M., Ferreira F., Briza P. Proteomic profiling of birch (Betula verrucosa) pollen extracts from different origins. Proteomics, 2011, Vol. 11, no. 8, pp. 1486-1498.
  5. Ferreira F.D., Hoffmann-Sommergruber K., Breiteneder H., Pettenburger K., Ebner C., Sommergruber W., Steiner R., Bohle B., Sperr W.R., Valent P. Purification and characterization of recombinant Bet v I, the major birch pollen allergen. Immunological equivalence to natural Bet v I. J. Biol. Chem., 1993, Vol. 268, no. 26, pp. 19574-19580.
  6. Friedl-Hajek R., Radauer C., O’Riordain G., Hoffmann-Sommergruber K., Leberl K., Scheiner O., Breiteneder H. New Bet v 1 isoforms including a naturally occurring truncated form of the protein derived from Austrian birch pollen. Mol. Immunol., 1999, vol. 36, no. 10, pp. 639-645.
  7. Hoffmann-Sommergruber K., Vanek-Krebitz M., Radauer C., Wen J., Ferreira F., Scheiner O., Breiteneder H. Genomic characterization of members of the Bet v 1 family: genes coding for allergens and pathogenesis-related proteins share intron positions. Gene, 1997, vol. 197, no. 1-2, pp. 91-100.
  8. Radauer C., Nandy A., Ferreira F., Goodman R.E., Larsen J.N., Lidholm J., Pomés A., Raulf-Heimsoth M., Rozynek P., Thomas W.R., Breiteneder H. Update of the WHO/IUIS Allergen Nomenclature Database based on analysis of allergen sequences. Allergy, 2014, Vol. 69, no. 4, pp. 413-419.
  9. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, Vol. 74, no. 12, pp. 5463-5467.
  10. Schenk M.F., Cordewener J.H., America A.H., Van’t Westende W.P., Smulders M.J., Gilissen L.J. Characterization of PR-10 genes from eight Betula species and detection of Bet v 1 isoforms in birch pollen. BMC Plant Biol., 2009, Vol. 9, no. 24, 24. doi: 10.1186/1471-2229-9-24.
  11. Schenk M.F., Gilissen L.J., Esselink G.D., Smulders M.J. Seven different genes encode a diverse mixture of isoforms of Bet v 1, the major birch pollen allergen. BMC Genomics, 2006, Vol. 7, 168. doi: 168.10.1186/1471-2164-7-168.
  12. Swoboda I., Jilek A., Ferreira F., Engel E., Hoffmann-Sommergruber K., Scheiner O., Kraft D., Breiteneder H., Pittenauer E., Schmid E. Isoforms of Bet v 1, the major birch pollen allergen, analyzed by liquid chromatography, mass spectrometry, and cDNA cloning. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, no. 6, pp. 2607-2613.
  13. von Loetzen C.S., Jacob T., Hartl-Spiegelhauer O., Vogel L., Schiller D., Spörlein-Güttler C., Schobert R., Vieths S., Hartl M. J., Rösch P. Ligand recognition of the major birch pollen allergen Bet v 1 is isoform dependent. PLoS One, 2015, Vol. 10, no. 6, e0128677. doi: 10.1371/journal.pone.0128677.
  14. Wagner S., Radauer C., Bublin M., Hoffmann-Sommergruber K., Kopp T., Greisenegger E.K., Vogel L., Vieths S., Scheiner O., Breiteneder H. Naturally occurring hypoallergenic Bet v 1 isoforms fail to induce IgE responses in individuals with birch pollen allergy. J. Allergy Clin. Immunol., 2008, Vol. 121, no. 1, pp. 246-252.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рисунок 1. Структура спектра изоформ Bet v 1

Скачать (322KB)
Метаданные

© Пархомчук О.Ю., Фомина Е.Г., Григорьева Е.Е., 2025

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах