Отправить статью по E-mail Экспериментальная модель синдрома Шегрена, сопровождающегося Т-лимфоцитопенией
- Авторы: Бедулева Л.В.1,2, Фомина К.В.1,2, Меньшикова Д.И.1, Терентьева О.С.1, Юшков Д.П.1
-
Учреждения:
- ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет»
- ФГБУН «Удмуртский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»
- Выпуск: Том 28, № 3 (2025)
- Страницы: 437-442
- Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
- Дата подачи: 22.02.2025
- Дата принятия к публикации: 01.05.2025
- Дата публикации: 07.09.2025
- URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/17096
- DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-17096-EMO
- ID: 17096
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Синдром Шегрена (СШ) – системное аутоиммунное заболевание, характеризующееся иммуноопосредованным повреждением слюнных и слезных желез. В 5-35% (по разным данным) случаев синдром Шегрена сопровождается периферической CD3 Т-лимфоцитопенией, которая коррелирует с высокой активностью болезни и смертностью. Механизмы развития лимфоцитопении при СШ не известны. Важным инструментом в понимании механизмов развития болезней служат экспериментальные модели. Существующие модели синдрома Шегрена воспроизводят типичные для первичного СШ человека повреждения слюнных желез, включая воспаление слюнных желез и секреторную дисфункцию, но не лимфоцитопению. В настоящем исследовании синдром Шегрена вызывали у крыс Wistar иммунизацией фракцией белков с молекулярной массой 10-35 кДа, выделенной из гомогената слюнных желез мыши методом эксклюзионной хроматографии на сорбенте SepFast SEC 3-70. Крысы получили 3 внутрикожные инъекции антигена – первые две в составе ПАФ, третью – в составе НАФ, с интервалом в 1 неделю. Количество CD3, CD3CD4, CD3CD8-лимфоцитов определяли до иммунизации, спустя 5 и 9 недель после иммунизации методом проточной цитофлуориметрии. Гистологический анализ поднижнечелюстных слюнных желез провели через 12 недель после первой иммунизации. Часть парафиновых срезов слюнных желез окрашивали гематоксилином и эозином, другую – антителами к CD3 крысы для детекции лимфоцитарной инфильтрации. У 33% крыс выявлено повреждение эпителия зернистых протоков и обнаружены множественные очаги гиперплазии протокового эпителия. Лимфоцитарной инфильтрации на срезах слюнных желез, полученных спустя 12 недель после инициирующей СШ иммунизации, не выявлено, что свидетельствует о транзиторном характере вызванной аутоиммунной реакции против антигенов слюнных желез. У 50% крыс, иммунизированных белками слюнных желез мыши, выявлена хроническая CD4 и CD8 Т-лимфоцитопения. Таким образом, нами получена экспериментальная модель аутоиммунного заболевания подобного синдрому Шегрена, которая помимо повреждения слюнных желез воспроизводит хроническую CD4- и CD8-лимфоцитопению. Представленная модель синдрома Шегрена адекватна заболеванию человека, пригодна для изучения его патогенеза и может быть использована для выяснения механизма развития лимфоцитопении при синдроме Шегрена.
Полный текст
Введение
Синдром Шегрена (СШ) – системное аутоиммунное заболевание, характеризующееся иммуноопосредованным повреждением слюнных и слезных желез, приводящим к ксеростомии и ксерофтальмии [12]. СШ может встречаться как самостоятельное заболевание (первичный СШ) или являться проявлением системной манифестации при других аутоиммунных заболеваниях (вторичный СШ), таких как системная красная волчанка (СКВ) и ревматоидный артрит (РА) [3]. При синдроме Шегрена, как и при многих других аутоиммунных заболеваниях, в тканях мишенях обнаруживается инфильтрация CD4 и CD8 Т-лимфоцитами [14], что указывает на роль Т-лимфоцитов в качестве эффекторов аутоиммунной реакции, наблюдается неспецифический хронический сиалоаденит, который характеризуется повреждением и расширением протоков, атрофией ацинусов и фиброзом [8].
У пациентов с первичным СШ в 5-35% (по разным данным) случаев встречается периферическая CD3 Т-лимфоцитопения, которая коррелирует с высокой активностью СШ и смертностью [1, 2]. Анализ субпопуляций T-клеток показал, что снижено может быть количество СD4 T-лимфоцитов, а именно наивных клеток, или одновременно и CD4, и CD8 Т-лимфоцитов. Снижение количества B-клеток и NK-клеток в крови при СШ также может иметь место. Механизмы развития лимфоцитопении при СШ не известны.
Полезным инструментом для изучения патогенеза аутоиммунных заболеваний служат их экспериментальные модели. Существующие модели СШ воспроизводят основные повреждения и нарушения, характерные для первичного СШ человека, включая воспаление слюнных желез и секреторную дисфункцию, но не воспроизводят лимфоцитопению [10].
Мы получили экспериментальную модель аутоиммунного заболевания подобного синдрому Шегрена, которая воспроизводит не только повреждение слюнных желез, но и хроническую CD4- и CD8-лимфоцитопению, встречающуюся у пациентов с синдромом Шегрена. Представленная экспериментальная модель СШ адекватна заболеванию человека и пригодна для изучения его патогенеза, в том числе механизмов развития лимфоцитопении.
Материалы и методы
Для получения гомогената слюнных желез у белых лабораторных мышей извлекали поднижнечелюстные слюнные железы, промывали ЗФР (рН = 7,2) и протирали через сито. Полученный грубый гомогенат разводили десятью объемами холодного ЗФР и гомогенизировали в ультразвуковой ванне (40 кГц) 10 минут. Далее 20 минут гомогенизировали со стеклянным шариком на шейкере Multi-Vortex V-32 (BioSan, Латвия) при +4 °C на максимальной скорости, после чего 10 минут центрифугировали при 15000 g. Надосадок фракционировали методом эксклюзионной хроматографии на сорбенте SepFast SEC 3-70 (BioToolomics, Великобритания), элюцию проводили ЗФР, при скорости потока 1 мл/мин, фракции анализировали электрофоретически. Фракцию белков с молекулярной массой 10-35 кДа концентрировали, смешивали с полным или неполным адъювантом Фрейнда (ПАФ/НАФ) (InvivoGen, США) в соотношении 1:1 и встряхивали на шейкере до получения стойкой эмульсии. Самцы крыс Wistar (n = 6, возраст 10 недель) («Рапполово», Россия) получили 3 внутрикожные инъекции антигена (100 мкг белка/крысу) – первые две в составе ПАФ, третью – в составе НАФ, с интервалом в 1 неделю. Контрольные животные (n = 3) получили 3 инъекции ЗФР/адъювант – первые две ЗФР/ПАФ, третья – ЗФР/ НАФ, с интервалом в 1 неделю. Кровь забирали у крыс из хвостовой вены перед иммунизацией и еженедельно в течение 9 недель. Количество CD3, CD3CD4, CD3CD8-лимфоцитов определяли методом проточной цитофлуориметрии. Для фенотипирования использовали антитела к CD3-PE/ Elab Fluor® 594 (Elabscience, Китай), антитела к CD4-PE/Cyanine7 (Elabscience, Китай), антитела к CD8-PE/Cyanine5.5 (Elabscience, Китай). Измерения проводили на проточном цитофлуориметре CytoFLEX Beckman Coulter. Через 12 недель после первой иммунизации белками слюнных желез крыс подвергали эвтаназии, извлекали поднижнечелюстные слюнные железы и готовили парафиновые срезы, часть из которых окрашивали гематоксилином и эозином, другую антителами к CD3 крысы (Elabscience, Китай) для детекции лимфоцитарной инфильтрации. Статистический анализ проводили с помощью GraphPad Prism 8.4.3. Для проверки нормальности данных использовался тест Шапиро–Уилка. Достоверность различий оценивалась с использованием теста повторных измерений ANOVA. Отличия считали значимыми при p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Через 12 недель после инициирующей синдром Шегрена иммунизации из крыс были извлечены поднижнечелюстные слюнные железы и проведен их гистологический анализ. У 33% иммунизированных крыс выявлено повреждение эпителия зернистых протоков (рис. 1А), что визуально выявлялось в виде их расширения. Кроме того, у крыс были выявлены множественные очаги гиперплазии протокового эпителия (рис. 1A).
Рисунок 1. Изменения у крыс с индуцированным синдромом Шегрена
Примечание. А, Б – поперечные срезы поднижнечелюстных слюнных желез крыс, иммунизированных белками, выделенными из гомогената слюнных желез мыши. А – слюнная железа с очагами гиперплазии (стрелки), разрушением протокового эпителия и расширением протоков (звездочки); Б – слюнная железа без повреждений. Окраска H&E. В – количество СD3, CD3CD4, CD3CD8-лимфоцитов в крови крыс, иммунизированных белками, выделенными из гомогената слюнных желез мыши. Данные представлены как среднее (n = 3) ±SD. * – статистически значимо по отношению к значению до иммунизации (тест повторных измерений ANOVA test, p < 0,05). ЛЦП – лимфоцитопения.
Figure 1. Rat model of Sjogren’s syndrome
Note. A, B, cross sections of the submandibular salivary glands of rats immunized with proteins isolated from mouse salivary gland homogenate. H&E staining. A, salivary gland with foci of hyperplasia (arrows), destruction of the ductal epithelium and dilation of the ducts (asterisks); B, salivary gland without damage. C, peripheral blood CD3, CD3CD4, CD3CD8 lymphocyte counts in rats immunized with proteins isolated from mouse salivary gland homogenate. The data are presented as mean (n = 3) ± SD. *, statistically significant in relation to pre-immunization level (ANOVA test, repeated measures, p < 0.05). LCP, lymphocytopenia.
Обнаруженное расширение протоков входит в состав комплекса повреждений слюнной железы при СШ, объединенных под общим названием «неспецифический хронический сиалоаденит» [8], и обнаруживается у 48% больных синдромом Шегрена [9], а гиперплазия эпителия протоков является одним из показателей лимфоэпителиальных поражений, характерных для 33% больных СШ [8, 9]. Следовательно, изменения, найденные в слюнных железах крыс, иммунизированных белками слюнных желез мышей, подобны изменениям при СШ.
Лимфоцитарная инфильтрация слюнных желез крыс отсутствовала. Наличие разрушений эпителия зернистых протоков и гиперплазии протокового эпителия при отсутствии инфильтрации, изученной спустя 12 недель после индукции СШ, указывает на то, что аутоиммунная реакция против антигенов слюнных желез носила транзиторный характер, и к 12-й неделе завершилась.
Как отмечалось выше, первичный СШ может сопровождаться периферической лимфоцитопенией.
Анализ количества лимфоцитов, СD3, CD3CD4, CD3CD8-клеток в периферической крови крыс с индуцированным СШ выявил CD4 и CD8 Т-лимфоцитопению у 50% крыс, иммунизированных белками слюнных желез (рис. 1B). В отличие от реакции против эпителия слюнных желез, которая была транзиторной, Т-лимфоцитопения носила хронический характер. Самое глубокое снижение количества CD4 и CD8-лимфоцитов найдено у крысы, характеризующейся сильным повреждением зернистых протоков.
Таким образом, вызванный у крыс Wistar синдром Шегрена воспроизводит не только повреждение слюнных желез, но и хроническую лимфоцитопению, в том числе CD4 и CD8-лимфоцитопению.
Лимфопенией нередко сопровождаются не только синдром Шегрена, но и другие аутоиммунные заболевания человека, такие как инсулин-зависимый сахарный диабет, РА, СКВ, анкилозирующий спондилит и целиакия [7]. Известен также редкий клинический синдром, получивший название идиопатическая CD4-лимфоцитопения, критериями которой являются истощение CD4 Т-лимфоцитов (абсолютный уровень Т-лимфоцитов CD4 < 300 клеток/мкл или < 20% от общего числа лимфоцитов как минимум в двух отдельных временных точках с интервалом не менее 6 недель) и как следствие СПИД-подобный синдром в отсутствие ВИЧ-инфекции или определенного иммунодефицита, или терапии, вызывающей снижение количества CD4 Т-клеток [16]. Среди пациентов с синдромом идиопатической CD4-лимфоцитопении распространены различные аутоиммунные заболевания, включая СКВ, болезнь Грейвса, антифосфолипидный синдром, аутоиммунная гемолитическая анемия, псориаз, витилиго, язвенный колит, аутоиммунный тиреоидит [4, 16], и их следует рассматривать как часть этого синдрома [4]. Лимфоцитопения при аутоиммунных заболеваниях является серьезной проблемой, усугубляет течение болезни и осложняет назначение лечения, так как требует отмены иммуносупрессантов. Механизмы развития лимфоцитопении и причинно-следственные связи между лимфоцитопенией и аутоиммунным заболеванием не ясны. При идиопатической CD4-лимфоцитопении выявлены аутоантитела против CD4 T-клеток, в том числе связанные с поверхностью CD4-лимфоцитов [5, 13, 15], что предполагает аутоиммунную природу идиопатической CD4-лимфоцитопении. Некоторые авторы рассматриваю лимфоцитарную недостаточность как причину развития аутоиммунного заболевания [7]. Предполагается, что лимфопения способствует гомеостатической пролиферации Т-лимфоцитов, направленной на поддержание размера популяции клеток, что может сопровождаться потерей разнообразия Т-клеточных рецепторов и увеличением количества аутореактивных эффекторных Т-клеток [6, 11].
Полученная нами экспериментальная модель может быть полезна для изучения феномена лимфоцитопении при синдроме Шегрена, выяснения механизма его развития и испытания средств терапии.
Заключение
Таким образом, нами получена новая экспериментальная модель аутоиммунного заболевания подобного синдрому Шегрена. В отличие от существующих экспериментальных моделей СШ, новая модель воспроизводит не только повреждение слюнных желез, но и хроническую лимфоцитопению в том числе CD4- и CD8-лимфоцитопению, встречающуюся у пациентов с синдромом Шегрена. Модель может быть использована для изучения патогенеза СШ, в том числе механизмов развития лимфоцитопении.
Об авторах
Л. В. Бедулева
ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет»; ФГБУН «Удмуртский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»
Email: fomiksa@yandex.ru
д.б.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории молекулярной и клеточной иммунологии, ведущий научный сотрудник лаборатории биосовместимых материалов
Россия, 426034, Удмуртская Республика, г. Ижевск, ул. Университетская, 1; г. Ижевск, Удмуртская РеспубликаКсения Владимировна Фомина
ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет»; ФГБУН «Удмуртский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»
Автор, ответственный за переписку.
Email: fomiksa@yandex.ru
к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярной и клеточной иммунологии, старший научный сотрудник лаборатории биосовместимых материалов
Россия, 426034, Удмуртская Республика, г. Ижевск, ул. Университетская, 1; г. Ижевск, Удмуртская РеспубликаД. И. Меньшикова
ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет»
Email: fomiksa@yandex.ru
инженер-исследователь лаборатории молекулярной и клеточной иммунологии
Россия, 426034, Удмуртская Республика, г. Ижевск, ул. Университетская, 1О. С. Терентьева
ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет»
Email: fomiksa@yandex.ru
младший научный сотрудник лаборатории молекулярной и клеточной иммунологии
Россия, 426034, Удмуртская Республика, г. Ижевск, ул. Университетская, 1Д. П. Юшков
ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет»
Email: fomiksa@yandex.ru
инженер-исследователь лаборатории молекулярной и клеточной иммунологии
Россия, 426034, Удмуртская Республика, г. Ижевск, ул. Университетская, 1Список литературы
- Aoki A., Ohno S., Ueda A., Ideguchi H., Ohkubo T., Hagiwara E., Shirai A., Oketani M., Nagaoka S., Senuma A., Ohota S., Matsunaga K., Ishigatsubo Y. Hematological abnormalities of primary Sjogren’s syndrome. Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi, 2000, Vol. 23, no. 2, pp. 124-128. (In Japanese)
- Brito-Zerón P., Kostov B., Solans R., Fraile G., Suárez-Cuervo C., Casanovas A., Rascón F.J., Qanneta R., Pérez-Alvarez R., Ripoll M., Akasbi M., Pinilla B., Bosch J.A., Nava-Mateos J., Díaz-López B., Morera-Morales M.L, Gheitasi H., Retamozo S., Ramos-Casals M.; SS Study Group, Autoimmune Diseases Study Group (GEAS), Spanish Society of Internal Medicine (SEMI). Systemic activity and mortality in primary Sjögren syndrome: predicting survival using the EULAR-SS Disease Activity Index (ESSDAI) in 1045 patients. Ann. Rheum. Dis., 2016, Vol. 75, no. 2, pp. 348-355.
- Chiorini J.A., Cihakova D., Ouellette C.E., Caturegli P. Sjögren syndrome: advances in the pathogenesis from animal models. J. Autoimmun., 2009, Vol. 33, no. 3-4, pp. 190-196.
- Cudrici C.D., Boulougoura A., Sheikh V., Freeman A., Sortino O., Katz J.D., Sereti I., Siegel R.M. Characterization of autoantibodies, immunophenotype and autoimmune disease in a prospective cohort of patients with idiopathic CD4 lymphocytopenia. Clin. Immunol., 2021, Vol. 224, 108664. doi: 10.1016/j.clim.2021.108664.
- Henriksson G., Manthorpe R., Bredberg A. Antibodies to CD4 in primary Sjögren’s syndrome. Rheumatology (Oxford), 2000, Vol. 39, no. 2, pp. 142-147.
- Khoruts A., Fraser J.M. A causal link between lymphopenia and autoimmunity. Immunol. Lett., 2005, Vol. 98, no. 1, pp. 23-31.
- King C., Ilic A., Koelsch K., Sarvetnick N. Homeostatic expansion of T cells during immune insufficiency generates autoimmunity. Cell, 2004, Vol. 117, no. 2, pp. 265-277.
- Liao R., Yang H.T., Li H., Liu L.X., Li K., Li J.J., Liang J., Hong X.P., Chen Y.L., Liu D.Z. Recent advances of salivary gland biopsy in Sjögren’s syndrome. Front. Med. (Lausanne), 2022, Vol. 8, 792593. doi: 10.3389/fmed.2021.792593.
- Llamas-Gutierrez F.J., Reyes E., Martínez B., Hernández-Molina G. Histopathological environment besides the focus score in Sjögren’s syndrome. Int. J. Rheum. Dis., 2014, Vol. 17, no. 8, pp. 898-903.
- Mieliauskaitė D., Kontenis V., Šiaurys A. Lessons from animal models in Sjögren’s syndrome. Int. J. Mol. Sci., 2023, Vol. 24, no. 16, 12995. doi: 10.3390/ijms241612995.
- Monti P., Scirpoli M., Maffi P., Ghidoli N., De Taddeo F., Bertuzzi F., Piemonti L., Falcone M., Secchi A., Bonifacio E. Islet transplantation in patients with autoimmune diabetes induces homeostatic cytokines that expand autoreactive memory T cells. J. Clin. Invest., 2008, Vol. 118, no. 5, pp. 1806-1814.
- Negrini S., Emmi G., Greco M., Borro M., Sardanelli F., Murdaca G., Indiveri F., Puppo F. Sjögren’s syndrome: a systemic autoimmune disease. Clin. Exp. Med., 2022, Vol. 22, no. 1, pp. 9-25.
- Perez-Diez A., Wong C.S., Liu X., Mystakelis H., Song J., Lu Y., Sheikh V., Bourgeois J.S., Lisco A., Laidlaw E., Cudrici C., Zhu C., Li Q.Z., Freeman A.F., Williamson P.R., Anderson M., Roby G., Tsang J.S., Siegel R., Sereti I. Prevalence and pathogenicity of autoantibodies in patients with idiopathic CD4 lymphopenia. J. Clin. Invest., 2020, Vol. 130, no. 10, pp. 5326-5337.
- Ríos-Ríos W.J., Sosa-Luis S.A., Torres-Aguilar H. T cells subsets in the immunopathology and treatment of Sjogren’s syndrome. Biomolecules, 2020, Vol. 10, no. 11, 1539. doi: 10.3390/biom10111539.
- Salit R.B., Hankey K.G., Yi R., Rapoport A.P., Mann D.L. Detection of CD4(+) T-cell antibodies in a patient with idiopathic CD4 T lymphocytopenia and cryptococcal meningitis. Br. J. Haematol., 2007, Vol. 139, no. 1, pp. 133-137.
- Zonios D.I., Falloon J., Bennett J.E., Shaw P.A., Chaitt D., Baseler M.W., Adelsberger J.W., Metcalf J.A., Polis M.A., Kovacs S.B., Kovacs J.A., Davey R.T., Lane H.C., Masur H., Sereti I. Idiopathic CD4+ lymphocytopenia: natural history and prognostic factors. Blood, 2008, Vol. 112, no. 2, pp. 287-294.
Дополнительные файлы
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).