Эффект трехмесячного поступления кремния с питьевой водой на морфологию авидин-позитивных тучных клеток селезенки мышей

Полный текст

Введение

Воздействие кремния, поступающего в организм с питьевой водой, исследуется нами уже на протяжении длительного времени. Отдельное внимание уделяется ТК, которые, как известно, вовлечены в процессы адаптации к окружающей среды и являются посредниками между нервными и иммунными процессами, проходящими в организме как в норме, так и при патологии. Использование окрашивания толуидиновым синим и вычисления индекса сульфатирования [4] позволило нам ранее выяснить, что ТК тимуса лабораторных крыс, получавших с питьевой водой кремний в течение двух месяцев, уменьшаются в размерах и содержат более сульфатированный гепарин, чем ТК крыс, получавших питьевую воду без добавления кремния. ТК селезенки крыс также имели тенденцию к метахромазии. Для исследования ТК в печени крыс в наших последних работах был использован меченный люминесцентной меткой авидин [3]. Известно, что гликопротеид авидин селективно связывается с гепарином [2, 6] и интенсивность его флуоресценции прямо пропорциональна количеству гепарина в гранулах [7]. Учитывая отсутствие данных литературы о влиянии кремния на популяцию ТК в селезенке мышей, в настоящей работе мы применили меченный люминесцентной меткой авидин.

Целью работы явилось изучение реакции авидин-позитивных ТК селезенки лабораторных мышей на поступление с питьевой водой кремния в концентрации 20 мг/л в течение трех месяцев.

Материалы и методы

Эксперименты были проведены на белых нелинейных лабораторных мышах-самцах (n = 6) в стандартных условиях вивария при естественном освещении.

Животные получали в течение трех месяцев питьевую бутилированную воду, в которую был добавлен девятиводный метасиликат натрия. Для контрольной группы (n = 3) массовая концентрация растворенных форм кремния составляла 10 мг/л, для опытной группы (n = 3) – 20 мг/л. Концентрацию кремния определяли спектрометром эмиссионным с индуктивно связанной плазмой 5110 ICP-OES [3]. После выведения из эксперимента у мышей извлекали селезенку, фиксировали ее в 10%-ном нейтральном формалине и заливали в парафин.

Депарафинированные срезы толщиной 6 мкм инкубировали 30 минут с авидином, меченным флуоресцентной меткой зеленого цвета (Avidin, Alexa Fluor^® 488 conjugate, Invitrogen, Германия), согласно протоколу, описанному нами при изучении ТК в печени крыс [3]. Готовые препараты изучали под люминесцентным микроскопом при длине волны возбуждающего света 495 нм [2]. Микрофотографии были сделаны на микроскопе Leica 1000 с помощью камеры Amscope Mu 1000 и объектива × 40, измерение площади ТК и интенсивность их флуоресценции проводили с применением в автоматическом режиме функции «цветной куб» в программе AmScope (версия 10.11.2024), интенсивность флуоресценции выражалась в условных единицах флуоресценции (у. е.). Для определения взаимосвязи между площадью клетки и ее интенсивностью флуоресценции использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r_s). При этом сила корреляционной связи считалась слабой при 0 < r_s < 0,29, средней – при 0,3 < r_s < 0,69, сильной – при 0,7 < r_s < 1,0.

Полученные в ходе измерения выборки проверяли на нормальность распределения с использованием критериев Шапиро–Уилка и Колмогорова–Смирнова. Поскольку распределение выборок было ненормальным, средние данные представлены как медиана (Me) и интерквартильный размах (Q_0,25-Q_0,75). В этом случае для определения статистической значимости использовали U-критерий Манна–Уитни. Различия средних величин считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

В красной пульпе селезенки мышей контрольной группы авидин-позитивные ТК имели яркую зеленую флуоресценцию, в единичных клетках приглушенного зеленого свечения визуализировались отдельные яркие гранулы. Количество ТК в красной пульпе селезенки опытной группы мышей, получавших с питьевой водой кремний, было визуально больше, чем у мышей контрольной группы. При этом визуализировались как очень яркие клетки, так и клетки с приглушенным зеленым свечением, среди которых также наблюдались клетки с единичными яркими гранулами. Количество ТК на поле зрения при увеличении ×400 составило в среднем 12-15 клеток, в то время как в селезенке мышей, получавших с питьевой водой кремний, их количество составило 20-22 клетки.

Медиана площади флуоресцирующих ТК, определенная с помощью функции «цветной куб», составила 60,52 (52,02-77,58) мкм² для мышей, получавших питьевую воду с кремнием в концентрации 10 мг/л, и 57,32 (42,01-75,29) мкм² для мышей, получавших питьевую воду с кремнием в концентрации 20 мг/л. Были проанализированы три размерные группы, полученные при помощи гистограммы: группа малых клеток (< 39,80 мкм²), группа средних клеток (39,80-82,40 мкм²), группа больших клеток (> 82,40 мкм²). Доля малых, средних и больших клеток в контрольной и опытной группе составила 12%, 67% и 21%, и 21%, 55% и 24% соответственно. Это свидетельствует о перераспределении клеток по размеру за счет увеличения доли малых клеток и уменьшения доли средних по размеру клеток. Доля больших по размеру ТК была сопоставима в обеих группах. Средняя интенсивность флуоресценции ТК селезенки мышей контрольной группы составила 95,01 (88,63-105,17) у. е., в то время как для мышей опытной группы этот показатель составил 105,2 (90,64-113,82) у. е. (p < 0,05). Коэффициент корреляции между размером клетки и интенсивностью люминесценции выявил прямую связь средней силы и для контрольной (r_s = 0,41), и для опытной групп (r_s = 0,50), то есть с увеличением размера клетки увеличивается количество в ней гранул гепарина, с которым связывается авидин. Средняя интенсивность флуоресценции ТК у мышей контрольной группы составила для малых, средних и больших клеток 88,63 (81,77-94,68) у. е., 105,17 (100,09-106,23) у. е. и 90,12 (86,04-102,90) у. е. соответственно, а в опытной – 89,705 (86,64-102,80) у. е., 105,84 (91,24-110,19) у. е. и 114,34 (104,53-119,79) у. е. соответственно. Полученные данные дополняют ранее собранную нами информацию об обеспеченности селезенки мышей гистамином при поступлении с питьевой водой кремния: наблюдалось уменьшение абсолютной люминесценции гистамина в красной пульпе селезенки мышей, получавших в течение трех месяцев с питьевой водой кремний в концентрации 20 мг/л [1]. Поскольку авидин связывается с гепарином, а гепарин способен связывать и дезактивировать нейромедиаторные биогенные амины [5], мы предполагаем, что ответственными за снижение интенсивности люминесценции гистамина в красной пульпе селезенки, а следовательно, и за снижение одного из компонентов иммунного воспаления являются ТК. То есть можно считать, что реакция селезенки мышей на поступление с питьевой водой кремния сходна с таковой у крыс в ранее проведенном нами эксперименте [1].

Заключение

Таким образом, поступление с питьевой водой кремния в концентрации 20 мг/л в течение трех месяцев приводит к перераспределению популяции ТК в красной пульпе селезенки мышей по размеру, к увеличению интенсивности флуоресценции авидин-позитивных ТК большого размера, что свидетельствует об увеличении в них количества гепарина.

Об авторах

В. С. Гордова

Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта

Автор, ответственный за переписку.
Email: crataegi@rambler.ru

к.м.н., доцент кафедры фундаментальной медицины Высшей школы медицины

Россия, Калининград

Е. А. Григорьева

Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова

Email: crataegi@rambler.ru

ассистент кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии

Россия, Чебоксары, Чувашская Республика

В. Е. Сергеева

Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова

Email: crataegi@rambler.ru

д.б.н., профессор кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии

Россия, Чебоксары, Чувашская Республика

А. Т. Смородченко

Медицинская школа Берлина – Университет здоровья и медицины

Email: crataegi@rambler.ru

д.м.н., профессор кафедры анатомии

Германия, Берлин

Список литературы

Дополнительные файлы