Прекультивирование клеток, подвергавшихся длительной криоконсервации, негативно влияет на пролиферативную активность Т-лимфоцитов

Полный текст

Введение

Пролиферация Т-лимфоцитов необходима для формирования эффективного адаптивного иммунного ответа. Использование проточной цитометрии для оценки пролиферативной активности Т-клеток служит рутинным методом в клеточной биологии, иммунологии, клинической медицине. Однако доступность образцов в больших количествах в определенное время и в определенном месте остается сложной задачей, поэтому сбор и криоконсервация мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) для последующего анализа являются обычной практикой. Вместе с тем негативными последствиями криоконсервации могут быть, например, снижение экспрессии поверхностных и/или внутриклеточных маркеров, а также изменение функциональной активности клеток [4, 9]. Для сглаживания эффектов криоконсервации рядом авторов был введен этап прекультивирования: отдых приготовленных после разморозки МКПК в культуральной среде в течение 14-18 часов при +37 °C [4, 8]. Считается, что процесс покоя удалит клетки, обреченные на гибель, и позволит «отдохнувшим» клеткам восстановить функциональные способности [6, 8]. Представленные в доступной литературе данные, как правило, отражают сравнение показателей функциональной активности свежеизолированных и криоконсервированных МКПК либо оценивают последствие сроков криоконсервации (1-12 мес.) на состояние и функции различных клеток [3, 4, 5, 9]. При этом авторы не всегда вносят в протокол исследования этап «отдыха» клеток.

Целью настоящей работы была оценка влияния прекультивирования клеток, подвергавшихся длительной (более трех лет) криоконсервации, на пролиферативную активность Т-лимфоцитов.

Материалы и методы

Объектом исследования служили МКПК 18 относительно здоровых доноров, среди которых преобладали мужчины (61%). Средний возраст обследованных субъектов составил 37,4±1,2 года. Исследование было одобрено этическим комитетом «ИЭГМ УрО РАН» (IRB 00010009), каждый участник подписал информированное согласие. Забор крови проводили в вакуумные пробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (Weihai Hongyu Medical Devices Co Ltd, Китай). Мононуклеарные клетки выделяли путем центрифугирования двукратно разведенной крови раствором фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS, Gibco, США) в градиенте плотности Диаколла (1,077, ООО «Диаэм», Россия). Выделенные клетки после двукратного отмывания в растворе DPBS помещали в термоинактивированную эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС, Biowest, Колумбия), содержащую 10% диметилсульфоксида (AppliChem, Германия). Криопробирки с клетками подвергали контролируемому замораживанию в коммерческих штативах CoolCell (Cоrning, США) в морозильной камере (-80 °С) в течение суток, после чего переносили в криохранилище с жидким азотом (-196 °С) до последующего использования. Средняя продолжительность хранения образцов составила 40±1,4 мес.

Перед проведением исследования криопробирки с МКПК размораживали (водяная баня, +37 °C). К клеткам, перенесенным в 15-мл пробирки, капельно вносили десятикратный объем полной питательной среды (ППС): RPMI-1640, содержащая 25 мМ Хепеса и 2 мМ L-глутамина (Gibco, США), 10% ЭТС, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma-Aldrich, США). После центрифугирования (400 g, 10 мин) клеточный осадок ресуспендировали в ППС. Подсчет жизнеспособных клеток проводили в камере Горяева с окраской трипановым синим. Доля жизнеспособных клеток составила не менее 92%.

Полученные клетки делили на две части, одну из которых сразу после разморозки (проба «свежеразмороженные») окрашивали 5 мкМ 5(6)-карбоксифлуоресцеина диацетат-N-сукцинимидилового эфира (CFSE, BioLegend, США) и инкубировали при +37 °C в течение 8 мин. Затем для прекращения реакции клетки дважды отмывали средой RPMI-1640, содержащей 20% ЭТС. После подсчета в камере Горяева клетки ресуспендировали в концентрации 1 × 10⁶/мл в ППС, содержащей 100 нг/мл интерлейкина-2 (IL-2, Gibco, США). Пролиферацию клеток индуцировали внесением фитогемагглютинина-П (ФГА, Serva, Германия) в конечной концентрации 15 мкг/мл. Пробы культивировали в течение 7 суток (+37 °C, 5% CO₂). Контролем служили нестимулированные клетки, окрашенные CFSE, и стимулированные пробы без красителя. На 3-4-е сутки культуральную среду в каждой пробе меняли на среду соответствующего состава. Вторую часть размороженных клеток помещали в пробирки с ППС и инкубировали в течение 18 часов (+37 °C, 5% CO₂), чтобы дать время на восстановление (проба «прекультивированные»). После этого клетки окрашивали CFSE и культивировали с ФГА или без него, согласно вышеописанному протоколу.

По окончании времени инкубации клетки собирали, окрашивали витальным красителем Zombie UV, моноклональными анти-CD3-BV605, анти-CD4-PE, анти-CD8-BV-510 антителами (BioLegend, США) и анализировали с использованием проточного цитофлуориметра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США). Среди стимулированных CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитов определяли долю пролиферирующих клеток (CFSE^low), подсчитывали число дочерних генераций и процент клеток, гибнущих в процессе деления (ZombieUV⁺CFSE^low).

Статистический анализ и визуализацию данных проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, США). Количественные данные представлены в виде медиан и интерквартильных размахов (Q_0,25-Q_0,75). Множественные сравнения между группами проводили с помощью критерия Тьюки. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез приняли равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Оценка пролиферативной активности Т-лимфоцитов, размороженных после длительной (более трех лет) криоконсервации и стимулированных in vitro в течение 7 суток, показала следующее. Доля CD4⁺CFSE^lowТ-клеток в пробах «свежеразмороженные» составила 79,5±2,3%, в образцах с прекультивированными клетками – 79,7±1,6%. Аналогичные показатели были установлены при оценке относительного количества поделившихся CD8⁺Т-лимфоцитов. Процент CD8⁺CFSE^low в пробах «свежеразмороженные» и «прекультивированные» составил 78,6±4,6% и 77,9±3,6% соответственно. Ранее рядом исследователей при оценке пролиферативной способности клеток, культивированных сразу после разморозки, было установлено, что доля CD4⁺CFSE^low и CD8⁺CFSE^low не превышала 30% [9]. Необходимо отметить, что в указанной работе использованная авторами культуральная среда не содержала IL-2. Поскольку IL-2 является важным фактором выживания Т-лимфоцитов [1], возможно, что его отсутствие в культуральной среде могло приводить к снижению митотической активности клеток. Кроме того, на функциональность клеток могут влиять такие факторы, как состав среды для заморозки и длительность криоконсервации, этап прекультивирования клеток, индукторы и продолжительность стимуляции, а также ряд других [2, 5, 8]. Полученные нами в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что почти 80% Т-лимфоцитов, размороженных после длительной (более трех лет) криоконсервации, отвечают на стимуляцию митогеном, индуцирующим переход клетки из состояния покоя к делению. При этом внесение в протокол исследования предварительного этапа «отдых» не влияет на относительное число пролиферирующих CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитов.

Вместе с тем проведенная нами оценка количества дочерних генераций, образуемых стимулированными в течение 7 суток Т-лимфоцитами, выявила негативный эффект этапа «отдых» (рис. 1).

 

Рисунок 1. Влияние прекультивирования прошедших криоконсервацию клеток на количество дочерних генераций, формируемых стимулированными Т-лимфоцитами

Примечание. Свежеразмороженные: приготовленные после разморозки клетки были окрашены CFSE, стимулированы фитогемагглютинином и культивированы в течение 7 суток. Прекультивированные: приготовленные после разморозки клетки были оставлены на 18 часов в полной питательной среде, затем окрашены CFSE, стимулированы фитогемагглютинином и культивированы в течение 7 суток (см. раздел «Материалы и методы»). Представлены медианы (горизонтальные линии), межквартильные размахи (прямоугольники) и 10-90%-ные интервалы (вертикальные отрезки). *** – p < 0,001 (однофакторный дисперсионный анализ с последующим сравнением с помощью критерия Тьюки).

Figure 1. Effect of cryopreserved cells precultivation on the number of daughter generations formed by stimulated T lymphocytes

Note. Freshly thawed: cells prepared after thawing were stained with CFSE, stimulated with phytohemagglutinin and cultured for 7 days. Precultivated: Cells prepared after thawing were left in complete culture medium for 18 hours, then stained with CFSE, stimulated with phytohemagglutinin and cultured for 7 days (see section “Materials and Methods”). Medians (horizontal lines), interquartile ranges (rectangles), and 10-90% intervals (vertical segments) are shown. ***, p < 0.001 (one-way ANOVA with post hoc comparisons using Tukey’s test).

 

Прекультивирование размороженных клеток существенно уменьшало число дочерних генераций, формируемых как CD4⁺, так и CD8⁺Т-лимфоцитами (p < 0,001). Исходя из того, что в пробах «прекультивированные» по сравнению с пробами «свежеразмороженные» снижение количества дочерних генераций не сопровождается изменением доли CFSE^low клеток, можно предположить следующее. В прошедших этап «отдыха» культурах клеток большее число Т-лимфоцитов вступают в деление, однако они совершают меньше митозов. Это справедливо, как для CD4⁺, так и CD8⁺ субпопуляций Т-лимфоцитов.

Известно, что криоконсервация и последующее размораживание запускают в клетках процессы, ведущие к гибели. Причинами этого могут быть физический стресс, вызывающий морфологические изменения, накопление в митохондриях и цитозоле свободных радикалов, активация рецепторов смерти и др. [7, 9]. Проведенная нами оценка жизнеспособности делящихся Т-лимфоцитов, стимулированных в течение 7 суток, показала следующее (рис. 2).

 

Рисунок 2. Влияние прекультивирования прошедших криоконсервацию клеток на долю гибнущих элементов среди вступивших в деление Т-лимфоцитов

Примечание. Свежеразмороженные: приготовленные после разморозки клетки были окрашены CFSE, стимулированы фитогемагглютинином и культивированы в течение 7 суток. Прекультивированные: приготовленные после разморозки клетки были оставлены на 18 часов в полной питательной среде, затем окрашены CFSE, стимулированы фитогемагглютинином и культивированы в течение 7 суток (см. раздел «Материалы и методы»). Представлены медианы (горизонтальные линии), межквартильные размахи (прямоугольники) и 10-90%-ные интервалы (вертикальные отрезки). ** – p < 0,01; *** – p < 0,001 (однофакторный дисперсионный анализ с последующим сравнением с помощью критерия Тьюки).

Figure 2. Effect of cryopreserved cells precultivation on the proportion of dying elements among dividing T lymphocytes

Note. Freshly thawed: cells prepared after thawing were stained with CFSE, stimulated with phytohemagglutinin and cultured for 7 days. Precultured: Cells prepared after thawing were left in complete culture medium for 18 hours, then stained with CFSE, stimulated with phytohemagglutinin and cultured for 7 days (see section “Materials and Methods”). Medians (horizontal lines), interquartile ranges (rectangles), and 10–90% intervals (vertical segments) are shown. **, p < 0.01; ***, p < 0.001 (one-way ANOVA with post hoc comparisons using Tukey’s test).

 

В пробах «свежеразмороженные» относительное количество CD4⁺ и CD8⁺Т-клеток, гибнущих в процессе деления, было сопоставимо. Вместе с тем прекультивирование клеток приводило к значительному увеличению доли умирающих элементов среди вступивших в деление CD4⁺Т-лимфоцитов (p < 0,001). При этом в пуле CD8⁺Т-клеток аналогичного последствия этапа «отдых» не было отмечено. Более того, после прекультивирования процент гибнущих элементов среди вступивших в деление CD8⁺Т-лимфоцитов был существенно ниже, чем среди CD4⁺Т-клеток (p < 0,01). Ранее рядом авторов было отмечено, что этап прекультивирования снижает процент гибнущих клеток среди лимфоцитов, оказывая положительное влияние на восстановление их функций [8]. Другими исследователями было показано, что дополнительный «отдых» не улучшал способность Т-лимфоцитов к продукции интерферона-гамма в ответ на стимуляцию разными антигенами по сравнению клетками, стимулированными непосредственно после разморозки [5]. В настоящей работе нами установлено, что прекультивирование размороженных после криоконсервации клеток приводит к увеличению доли гибнущих в процессе деления Т-лимфоцитов, стимулированных в течение 7 суток. При данных экспериментальных условиях CD4⁺Т-клетки оказываются наиболее чувствительными к гибели по сравнению с CD8⁺Т-лимфоцитами.

Таким образом, хотя криоконсервация клеток является рутинным методом для последующей оценки их функционального состояния, данные, представленные в доступной литературе, весьма противоречивы. Поскольку после разморозки Т-лимфоциты демонстрируют относительно высокую выживаемость и способность к пролиферации, большинство исследований, как правило, сфокусированы на сравнении и оптимизации различных методологических подходов [4, 5, 8, 9]. Так, группой авторов был отмечен позитивный эффект этапа «отдых» на восстановление ряда функций Т-лимфоцитов [8], тогда как другими исследователями этого не выявлено [5]. В настоящей работе нами проведена оценка влияния этапа «отдых» размороженных после длительной (более трех лет) криоконсервации мононуклеарных клеток периферической крови на пролиферативную активность Т-лимфоцитов, стимулированных в течение 7 суток. Мы показали, что среди прошедших прекультивирование клеток доля пролиферирующих CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитов была сопоставима с таковой в пробах, не подвергавшихся процедуре «отдых». Вместе с тем нами был выявлен негативный эффект прекультивирования клеток на количество дочерних генераций, формируемых стимулированными CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитами. Более того, дополнительный «отдых» клеток существенно увеличивал относительное число Т-лимфоцитов, гибнущих в процессе деления. Важно отметить, что данный феномен был обнаружен только среди CD4⁺Т-клеток, что, по-видимому, отражает их большую чувствительность к гибели in vitro по сравнению с CD8⁺Т-лимфоцитами.

Выводы

На основании вышеизложенного можно заключить, что к проведению культуральных исследований по оценке пролиферативной способности Т-лимфоцитов, подвергавшихся длительной криоконсервации, необходимо приступать незамедлительно после разморозки клеток. Это не только значительно снижает смертность продолжительно культивируемых клеток, но и позволяет жизнеспособным делящимся лимфоцитам давать большее количество дочерних генераций.

Благодарности

Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП «Исследование материалов и вещества» ПФИЦ УрО РАН. Авторы выражают благодарность зав. лаборатории молекулярной иммунологии «ИЭГМ УрО РАН» д.б.н. Сайдаковой Е.В. и м.н.с. лаборатории молекулярной иммунологии «ИЭГМ УрО РАН» Пономаревой В.Н.

Об авторах

Лариса Борисовна Королевская

ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: bioqueen@mail.ru

к.м.н., научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии, Институт экологии и генетики микроорганизмов

Россия, г. Пермь

К. В. Шмагель

ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук

Email: bioqueen@mail.ru

д.м.н., заведующий лабораторией экологической иммунологии, Институт экологии и генетики микроорганизмов

Россия, г. Пермь

Список литературы

Дополнительные файлы