Сравнительная характеристика влияния альфа-липоевой кислоты и аминодигидрофталазиндиона натрия на гематологические показатели старых крыс с экспериментальным диабетом

Полный текст

Введение

Пожилые люди являются группой с высоким риском возникновения сахарного диабета (СД) [8]. Как старение, так и диабет способны изменять гематологические параметры, влияя на общее состояние здоровья и риск возникновения различных заболеваний. Пожилые люди часто демонстрируют сниженные уровни гемоглобина (Hb) и гематокрита (Ht), что коррелирует с такими патологическими состояниями, как сердечно-сосудистые заболевания и диабет [10]. У пациентов с СД гематологические изменения, как правило, связаны с выработкой активных форм кислорода в результате длительной гипергликемии [6]. Эти изменения выражаются в значительном снижении уровня Hb, Ht, среднего объема эритроцитов (MCV) и среднего содержания гемоглобина в эритроците (MCH) [7]. Кроме того, у диабетиков часто наблюдается повышенное общее количество лейкоцитов (TLC), что указывает на возникший воспалительный ответ на фоне развития СД [11].

В дополнение к вышесказанному важно отметить, что в процессе старения окислительный стресс и воспаление играют важную роль в патогенезе СД по причине того, что эти процессы взаимосвязаны и создают порочный круг, ухудшая состояние больных диабетом [9]. В связи с этим для коррекции патологических процессов, возникших на фоне развития СД, активно используют антиоксиданты и противовоспалительные препараты. На сегодняшний день показано, что альфа-липоевая кислота (ЛК) за счет своей антиоксидантной активности способна не только корригировать метаболические нарушения при СД, но и потенциально улучшать состояние анемии у пациентов с СД, проходящих гемодиализ [5]. В исследованиях на животных с экспериментальным СД были продемонстрированы иммуномодулирующие и противовоспалительные свойства препарата аминодигидрофталазиндиона натрия (АФГ) [1, 2]. Однако эффекты влияния АФГ на гематологические параметры крови напрямую не исследовались.

Таким образом, необходимы дополнительные исследования влияния антиоксидантов и противовоспалительных препаратов на гематологические параметры в контексте аддитивного влияния старения и диабета на модели старых животных с экспериментальным СД.

Цель – оценить и сравнить влияние ЛК и АФГ на биохимические и гематологические параметры старых крыс с аллоксан-индуцированным СД.

Материалы и методы

Исследование выполнено на 35 белых крысах самцах стока Wistar, которые содержались в стандартных условиях вивария ИИФ УрО РАН. Эксперимент на животных был одобрен локальным этическим комитетом ИИФ УрО РАН и выполнен в соответствии с принципами, сформулированными в Директиве 2010/63/ЕС Европейского парламента и Европейского совета от 22 сентября 2010 г. о защите животных, используемых в научных целях (Официальный журнал Европейского союза, 2010 г.).

Животные были разделены на 5 групп, по 7 животных в каждой: 1-я – молодые интактные животные возрастом 5 месяцев, 2-я – контрольная группа, старые интактные животные возрастом 18 месяцев, 3-я – старые животные возрастом 18 месяцев с экспериментальным СД, 4-я – старые животные возрастом 18 месяцев с экспериментальным СД и введением АЛК, 5-я – старые животные возрастом 18 месяцев с экспериментальным СД и введением АФГ. Сахарный диабет моделировали путем введения аллоксана по авторской методике [3]. Альфа-липоевая кислота (препарат «Октолипен», Россия) вводилась животным с СД в виде готового раствора (30 мг/мл) один раз в два дня в течение 30 дней. Препарат ставился внутримышечно с дозировкой 4 мг/100 г веса животного. Аминодигидрофталазиндион натрия (препарат Тамерит^®, Россия) вводился по следующей схеме: 10 дней – ежедневно, 5 дней – через день, 15 дней – через 2 дня, спустя 30 дней после первой инъекции аллоксана. Свежеприготовленный препарат ставился внутримышечно с дозировкой 2 мг/100 г веса животного. Через 60 дней все животные выводились из эксперимента посредством ингаляционной анестезии изофлураном с предварительным внутримышечным введением ксилазина (Alfasan, Woerden, Нидерланды) в дозе 0,1 мг/кг и золетила-100 в дозе 5 мг/ кг (Virbac, Carros, Франция).

Перед выведением у животных натощак проводили забор периферической крови для проведения гематологического анализа, биохимического определения содержания глюкозы и гликированного гемоглобина (HbA1c). Гематологический анализ проводился с помощью автоматического гематологического анализатора Mindray BC-2800Vet (Mindray, Китай). Концентрацию глюкозы в плазме крови определяли унифицированным глюкозооксидазным колориметрическим методом набором «Глюкоза-Ново (500)» (АО «Вектор-Бест», г. Новосибирск, Россия), содержание гликированного гемоглобина в цельной крови – методом аффинной гель хроматографии с использованием набора реактивов «Диабет-тест» (ФОСФОСОРБ, Москва).

Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием программы GraphPad Prizm 8.0.2 (GraphPad Software Inc., США) и Microsoft Exсel 2010. Данные представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (M±m). Для оценки достоверности различий нескольких независимых выборок использовался однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Статистически значимыми считали различия при р ≤ 0,05.

Результаты и обсуждение

При оценке биохимических показателей у крыс с экспериментальным СД наблюдалась гипергликемия без значимого влияния на уровень гликированного гемоглобина вследствие недлительного повышения уровня глюкозы. Введение крысам-диабетикам препаратов ЛК и АФГ одинаково корригировало метаболические нарушения, что выражалось в достоверном снижении уровня глюкозы до показателей интактных животных (табл. 1).

 

ТАБЛИЦА 1. ИЗМЕНЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ И ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРОВИ КРЫС РАЗНЫХ ГРУПП, M±m

TABLE 1. CHANGES IN BIOCHEMICAL AND HEMATOLOGICAL BLOOD PARAMETERS OF RATS IN DIFFERENT GROUPS, M±m

Показатель Parameter	Интактные, 5 мес. Intact, 5 mo. n = 7	Интактные 18 мес. (контроль) Intact, 18 mo. (control) n = 7	СД17, 18 мес. DM17, 18 mo. n = 7	СД17 + ЛК, 18 мес. DM17 + LA, 18 mo. n = 7	СД17 + АФГ, 18 мес. DM17 + APG, 18 mo. n = 7
Биохимические показатели крови крыс / Biochemical parameters of rat blood
Глюкоза, ммоль/л Glucose, mmol/L	7,70±0,30	9,80±0,04	14,60±2,93*	6,40±0,32 ***	6,56±0,68 ***
HbA1c, % HbA1c, %	5,00±0,13	5,08±0,30	6,10±0,71	4,65±0,30	4,64±0,21
Показатели красной крови крыс / Red blood cell counts in rats
Эритроциты, млн/мкл Red blood cells, 106/µL	9,76±0,19	8,96±0,16	9,81±0,15	8,57±0,37	11,49±0,55 *, **, ***, ****
Гемоглобин, г/л Hemoglobin, g/L	176,43±4,54	158,33±3,89	153,30±0,29*	149,50±4,84*	175,20±8,25 ****
Гематокрит, % Hematocrit, %	49,89±1,20	43,10±1,98	46,00±0,91	46,50±1,52	56,38±2,66 **, ***, ****
Средний объем эритроцитов, фл Mean corpuscular volume, fL	51,16±0,58	48,10±2,37	46,92±0,30*	54,38±0,90 **, ***	49,10±1,09 ****
Среднее содержание гемоглобина в эритроците, пг Mean concentration hemoglobin, pg	18,01±0,27	17,70±0,62	15,65±0,16 *, **	17,53±0,49 ***	15,30±0,56 *, **, ****
Средняя концентрация гемоглобина в эритроците, г/л Mean corpuscular hemoglobin concentration, g/L	353,00±2,75	368,00±8,69	333,00±0,21 *, **	321,50±3,57 *, **	311,40±5,11 *, **, ***
Ширина распределения эритроцитов по объему, % Red cell distribution, %	12,59±0,31	16,67±0,32*	17,52±0,31*	16,18±0,40*	18,14±0,42 *, ****
Показатели белой крови крыс / White blood cell counts in rats
Лейкоциты, тыс/мкл White blood cells, 103/µL	12,61±1,37	12,73±2,09	12,83±1,69	9,63±3,82	22,12±14,94
Лимфоциты, тыс/мкл Lymphocytes, 103/µL	8,80±1,01	5,27±0,60	7,02±1,19	3,43±0,72	10,74±8,81
Лимфоциты, % Lymphocytes, %	69,47±1,36	38,67±1,78*	53,33±1,49*	41,00±7,24*	36,80±5,72 *, ***
Моноциты, тыс/мкл Monocytes, 103/µL	0,37±0,06	1,23±0,32	1,42±0,22	0,55±0,20	2,52±2,26
Моноциты, % Monocytes, %	2,94±0,15	10,00±3,08	10,83±0,70*	8,25±2,88	7,00±2,18
Гранулоциты, тыс/мкл Granulocytes, 103/µL	3,44±0,34	6,23±1,64	4,40±0,37	5,65±3,33	8,86±3,90
Гранулоциты, % Granulocytes, %	27,59±1,29	48,00±3,08	35,83±1,71	50,75±10,02*	56,20±7,77*
Показатели тромбоцитарного звена крови / Blood platelet indices
Тромбоциты, тыс/мкл Platelets, 103/µL	1094,71±68,44	885,00±131,87	947,67±38,46	721,00±49,72*	703,00±62,59*
Тромбокрит, % Thrombocrit, %	0,68±0,04	0,59±0,09*	0,63±0,02**	11,10±0,12 *, ***	11,02±0,08 *, ***
Средний объем тромбоцитов, фл Mean platelets volume, fL	6,21±0,05	6,63±0,16*	6,63±0,08 *, **	0,46±0,04 *, ***	0,46±0,04 *, ***
Показатель гетерогенности тромбоцитов, % Platelet distribution width, %	15,64±0,07	10,80±0,07*	11,23±0,10 *, **	6,38±0,13 *, ***	6,58±0,07 *, ***

 

Примечание. * – статистические различия с группой инт. 5 мес.; ** – статистические различия с группой инт. 18 мес.; *** – статистические различия с группой СД17 18 мес.; **** – статистические различия с группой СД17 + ЛК 18 мес. (ANNOVA, p ≤ 0,05).

Note. *, statistical differences with the group int. 5 mo.; **, statistical differences with the group int. 18 mo.; ***, statistical differences with the group DM17 18 mo.; ****, statistical differences with the group DM17 + LA, 18 mo. (ANNOVA, p ≤ 0.05).

 

При сравнении гематологических показателей красной крови интактных крыс двух возрастов было отмечено различие лишь в показателе ширины распределения эритроцитов. Видимо, с возрастом происходит увеличение аномальных форм эритроцитов, что характерно для анизоцитоза. У старых животных с экспериментальным диабетом сохраняется тенденция к анизоцитозу, что подтверждается исследованиями [4]. В сравнении с молодыми животными у крыс с аллоксановым диабетом отмечено снижение среднего объема эритроцитов, хотя значимых отличий в показателях содержания эритроцитов в периферической крови и гематокрите выявлено не было. В этой группе также было отмечено снижение концентрации гемоглобина, что отразилось на показателях среднего содержания и концентрации гемоглобина в эритроците. По сравнению с контрольной группой у крыс-диабетиков два последних показателя были достоверно ниже. Исследованные препараты влияли на показатели красной крови неодинаково. При введении ЛК отмечался рост показателей анизоцидоза, среднего объема эритроцитов и среднего содержания гемоглобина в эритроците, хотя концентрация самого гемоглобина и его средняя концентрация в эритроците, напротив, снизились. Это может свидетельствовать о тенденции к гиперхромии и неоднородности популяции красных клеток крови. В отличие от ЛК введение АФГ достоверно увеличивало абсолютное содержание эритроцитов, концентрацию гемоглобина и показатель гематокрита, а также увеличивало показатель ширины распределения эритроцитов по объему. При этом средний объем эритроцитов, среднее содержание и концентрация гемоглобина в эритроците были снижены. Это может свидетельствовать об изменениях в эритроцитарном ростке и активации эритропоэза.

По результатам анализа показателей белой крови интактных крыс разных возрастов было зарегистрировано снижение относительного содержания лейкоцитов в группе старых животных. В сравнении с молодыми животными моделирование аллоксанового диабета отразилось на достоверном снижении относительного содержания лимфоцитов и увеличении относительного содержания моноцитов. Введение препаратов ЛК и АФГ имело схожее корригирующее влияние на показатели белой крови крыс с СД. Оба препарата значимо снижали относительное содержание лимфоцитов и достоверно увеличивали относительное содержание гранулоцитов.

Со стороны тромбоцитарного звена по сравнению с молодыми крысами в контрольной группе наблюдалось снижение показателей тромбокрита и гетерогенности тромбоцитов, а средний объем тромбоцитов, наоборот, увеличился. Аллоксан-индуцированный СД способствовал достоверному увеличению этих трех показателей у крыс-диабетиков. Препараты АЛ и АФГ имели схожее влияние на показатели тромбоцитарного звена крыс с СД. В обеих группах наблюдалось снижение общего числа тромбоцитов, их среднего объема и показателя анизоцитоза тромбоцитов. Введение ЛК и АФГ одинаково достоверно увеличивало показатель тромбокрита крыс.

Выводы

1. Введение как ЛК, так и АФГ воздействовало на состояние гипергликемии животных с аллоксан-индуцированным СД путем снижения уровня глюкозы. Исследованные ЛК и АФГ имели схожее влияние на показатели белой крови и тромбоцитарного звена крыс, но обладали разными корригирующими свойствами на показатели красной крови крыс с аллоксановым СД.
2. Введение ЛК, как и АФГ, животным с экспериментальным СД способствовало перераспределению типов лейкоцитов за счет снижения относительного числа лимфоцитов и увеличения относительного числа гранулоцитов. Препарат ЛК в большей мере способствовал анизоцитозу и гетерохромии эритроцитов, а также тромбоцитопении и снижению показателя анизоцитоза тромбоцитов.
3. Введение АФГ животным с аллоксан-индуцированным СД, напротив, оказывало влияние преимущественно на показатели красной крови за счет возможной стимуляции эритропоэза.

Об авторах

Любовь Александровна Среднева

ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» Уральского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: lyubabio44@gmail.com

младший научный сотрудник лаборатории морфологии и биохимии

Россия, 620049, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106

Т. Р. Султанова

ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» Уральского отделения Российской академии наук

Email: lyubabio44@gmail.com

младший научный сотрудник лаборатории морфологии и биохимии

Россия, 620049, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106

Список литературы

Дополнительные файлы