Фенотипическая характеристика дважды позитивных Т-клеток в периферической крови условно здоровых доноров

Полный текст

Введение

В периферической крови человека помимо CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитов обнаруживаются и дважды позитивные (англ. double-positive, DP) Т-клетки, характеризующиеся одновременной экспрессией CD4 и CD8. Ранее считалось, что появление этих клеток в циркуляции указывает на сбой селекции Т-лимфоцитов в тимусе, однако исследования последних лет опровергли эту теорию. Несмотря на инволюцию тимуса, с возрастом количество DP Т-клеток в периферической крови человека увеличивается [1], что противоречит теории о центральном происхождении этих клеток. Более того, M. Nascimbeni и соавт. показали, что CD4⁺CD8⁺Т-лимфоциты имеют сниженное количество эксцизионных колец Т-клеточного рецептора (англ. T-cell receptor excision circles, TREC), и на их поверхности отсутствует молекула CD1a, отражающая ранние этапы созревания Т-лимфоцитов [8]. Таким образом, DP Т-клетки, обнаруженные в циркуляции, вероятно, имеют периферическое происхождение. Современные исследования выдвигают теорию, заключающуюся в происхождении CD4⁺CD8⁺Т-лимфоцитов от своих монопозитивных аналогов – CD4⁺ и CD8⁺Т-клеток. Более того, если предшественником DP Т-клетки выступал CD4⁺Т-лимфоцит, то ее фенотип будет представлен CD4^brightCD8^dim, если же CD8⁺Т-лимфоцит был предшественником – DP Т-клетка будет обладать фенотипом CD4^dimCD8^bright [1]. Считается, что данное переключение фенотипа происходит после взаимодействия Т-лимфоцита с антиген-презентирующей клеткой, что при распознавании антигена вызывает смещение баланса между конститутивными факторами транскрипции CD4⁺ и CD8⁺Т-клеток в ту или иную сторону. Таким образом, в Т-лимфоците, изначально экспрессирующим CD4, снижается экспрессия ThPOK и запускается синтез Runx3, следствием которого служит экспрессия CD8. В отличие от CD8⁺Т-лимфоцитов и CD4^dimCD8^brightT-клеток, у CD4^brightCD8^dim Т-лимфоцитов корецептор CD8 представлен двумя альфа-цепями. В свою очередь, CD8-позитивная Т-клетка при контакте с антигеном способна снижать экспрессию Runx3 и запускать синтез ThPOK, что вызывает переход CD8⁺Т-лимфоцита в CD4^dimCD8^bright фенотип DP Т-клетки [9]. Функции двух представленных выше субпопуляций DP Т-клеток в настоящее время до конца не изучены. Считается, что в зависимости от заболевания меняется их функциональный профиль. Так, при аутоиммунных заболеваниях DP Т-клетки оказывают иммуносупрессивное действие. Например, при системной красной волчанке эти клетки подавляют выработку аутоантител [11], а при синдроме Шегрена отрицательно коррелируют с активностью заболевания [10]. В случае инфекционных заболеваниях DP Т-клетки играют защитную роль. Так, при ВИЧ-инфекции эти лимфоциты обладали высоким пролиферативным и эффекторным потенциалом, превышающим таковой их монопозитивных предшественников [2]. В свою очередь, при геморрагической лихорадке с почечным синдромом в периферической крови увеличивается количество DP Т-клеток. Причем эти лимфоциты обладают высокой экспрессией гранзима B и CD107a, что отражает их эффекторные свойства [12]. Таким образом, фенотип и функции CD4^brightCD8^dim и CD4^dimCD8^brightТ-лимфоцитов варьируются в зависимости от патологических состояний. В свою очередь, характеристики вышеперечисленных клеток при физиологической норме также оставляют ряд вопросов. Целью этого исследования выступало выявление фенотипических особенностей CD4^brightCD8^dim и CD4^dimCD8^brightТ-лимфоцитов в периферической крови условно здоровых доноров в зависимости от экспрессии маркеров созревания.

Материалы и методы

Объектом исследования служила периферическая кровь, полученная от 51 условно здорового добровольца (24 женщины, 27 мужчин, возраст 35 лет (27-46)). Данное исследование было одобрено этическим комитетом ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (протокол № 3/22 от 23.06.2022) и проводилось с информированного согласия испытуемых.

В рамках подготовки образцов периферической крови для проточной цитометрии применялась следующая комбинация моноклональных антител против поверхностных антигенов человека: CD57 (клон NC1, конъюгирован с FITC), CD62L (клон DREG56, конъюгирован с ECD), CD28 (клон CD28.2, конъюгирован с PerCP/Cy5.5), CD27 (клон 1A4CD27, конъюгирован с Pe/Cy7), CD4 (клон 13B8.2, конъюгирован с APC), CD8 (клон B9.11, конъюгирован с APC-AF700), CD3 (клон UCHT1, конъюгирован с APC-AF750), CD45RA (клон 2H4, конъюгирован с Pacific Blue) и CD45 (клон J33, конъюгирован с Krome Orange). Все антитела применялись в соответствие с рекомендациями производителя Beckman Coulter (США). Для удаления эритроцитов использовали коммерческий буфер VersaLyse Lysing Solution (Beckman Coulter, США). По завершении разрушения эритроцитов (15 минут при комнатной температуре в темноте), в образцы добавлялись частицы для абсолютного счета Flow-Count Fluorospheres (Beckman Coulter, США) в объеме, аналогичном объему периферической крови. Сбор цитометрических данных осуществляли на проточном цитометре Navios 3/10 (Beckman Coulter, США), оснащенном программным обеспечением Navios Software 1.2 (Beckman Coulter, США). В каждом образце анализировалось не менее 60 000 CD3⁺Т-клеток периферической крови. Детальные характеристики использованных реагентов и особенности подготовки образцов для анализа были описаны нами ранее [5, 6].

Обработка полученных результатов проточной цитометрии была проведена с использованием FlowJo™ v10 474 Software (BD Bioscience Inc., США; www.flowjo.com). Статистическая обработка данных проведена с использованием программы IBM SPSS software v26 (SPSS Inc., США; www.ibm.com). Для проверки на нормальность распределения использовались критерии Шапиро–Уилка и Колмогорова–Смирнова. Достоверность различий оценена при помощи непараметрического U-критерия Манна–Уитни. Результаты статистических обсчетов представлены в виде медианы и интерквартильного размаха – Me (Q_0,25-Q_0,75).

Результаты и обсуждение

В рамках проведенного исследования было обнаружено, что относительное содержание общего пула DP Т-клеток в рамках общей популяции CD3⁺Т-лимфоцитов составляет 0,73% (0,42- 1,61) при общей концентрации 11 кл/1μL (6-20). Причем процентное содержание CD8^dimCD4^bright и CD4^dimCD8^brightT-клеток находится в пределах 0,25% (0,18-0,44) и 0,29% (0,20-0,98) соответственно, при концентрациях 4 кл/1μL (2- 7) и 5 кл/1μL (2-12) соответственно. Так, M.S. Gonzalez-Mancera и соавт. показали, что DP Т-клетки составляли 2,60% (1,70-3,67), тогда как уровни CD4^highCD8^low и CD4^lowCD8^highТ-клеток находились в пределах 1,15% (0,80-2,00) и 0,90% (0,50-1,67) соответственно [4]. Возможно, уровни этих клеток могли увеличиваться по мере старения организма, а значения, полученные для лиц пожилого возраста, обычно превосходили таковые у условно здоровых добровольцев более младших возрастов [3].

Далее, чтобы сравнить распределение субпопуляций DP Т-клеток по созреванию и их монопозитивных аналогов, были проанализированы CD45RA и CD62L на CD8^dimCD4^bright, CD4^dimCD8^bright, CD4⁺ и CD8⁺Т-клетках. Были выявлены «наивные» клетки (CD45RA⁺CD62L⁺), центральные и эффекторные клетки памяти (CD45RA^-CD62L⁺ и CD45RA^-CD62L^- соответственно) и эффекторные клетки памяти, повторно экспрессирующие CD45RA (TEMRA) с фенотипом CD45RA⁺CD62L^-. В Т-лимфоцитах с фенотипом CD8^dimCD4^bright преобладали клетки эффекторной памяти и TEMRA (64,44% (50,00-75,00) против 22,03% (16,31-26,71) среди CD4⁺Т-клеток при p < 0,001 и 1,43% (0,00-10,71) против 0,24% (0,18-0,57) среди CD4⁺Т-клеток при p = 0,013 соответственно) (рис. 1А, Б). В случае CD4^dimCD8^brightT-клеток преобладали клетки центральной памяти (36,00% (23,08-60,38) против 13,26% (9,36-16,89) среди CD8⁺Т-клеток при p < 0,001) (рис. 1В, Г). Более того, в популяциях CD8^dimCD4^bright и CD4^dimCD8^brightT-клеток был отмечен пониженный уровень «наивных» клеток (2,94% (1,22-7,43) против 33,02% (24,36-42,70) среди CD4⁺Т-клеток при p < 0,001, и 11,32% (2,35-17,28) против 39,22% (28,35-48,42) среди CD8⁺Т-клеток при p < 0,001 соответственно) (рис. 1Б, Г). Таким образом, DP Т-клетки обладают преимущественно фенотипом памяти: в CD8^dimCD4^brightТ-лимфоцитах преобладает эффекторный фенотип памяти, тогда как в CD4^dimCD8^bright преобладает фенотип центральной памяти. Эти результаты косвенно подтверждают теорию о формировании DP Т-клеток на периферии после контакта с антигеном. Следует отметить, что Nascimbeni M. и соавт. показали, что CD4^dimCD8^brightT-клетки преимущественно обладают фенотипом эффекторных клеток памяти с фенотипом CCR7^-CD45RA^-, в то время как CD4^brightCD8^dim T-клетки в основном характеризуются фенотипом центральных клеток памяти CCR7⁺CD45RA^- [8]. Возможно, разница в результатах объясняется размерами выборки и возрастом доноров.

Рисунок 1. Распределение основных субпопуляций Т-лимфоцитов в зависимости от экспрессии CD62L и CD45RA. Примечание. Круговые диаграммы А-Г показывают относительное количество лимфоцитов с фенотипом «наивных» клеток (CD45RA⁺CD62L⁺) – белый цвет, клеток центральной памяти (CM, CD45RA-CD62L⁺) – серый цвет, клеток эффекторной памяти (EM, CD45RA-CD62L-) – темно-серый цвет и терминально дифференцированных CD45RA-позитивных эффекторных клеток памяти (CD45RA⁺CD62L-) – черный цвет. Круговая диаграмма А показывает распределение фенотипов среди CD3⁺CD4⁺, диаграмма Б – среди CD8dimCD4bright, диаграмма В – относительно CD3⁺CD8⁺ и диаграмма Г – распределение фенотипов среди CD4^dimCD8^bright. 

Затем на поверхности субпопуляций DP Т-клеток были проанализированы костимуляционные молекулы CD27 и CD28, а также маркер клеточного «старения» CD57. Было выявлено повышение экспрессии CD57 на поверхности CD8^dimCD4^brightТ-лимфоцитов (12,90% (4,00-43,70) против 8,69% (6,36-11,73) и 1,07% (0,51-4,07) на поверхности CD4⁺Т-клеток при p < 0,001) (рис. 2В). При этом экспрессия CD27 и CD28 на поверхности CD8^dimCD4^brightT-клеток была ниже по сравнению с CD4⁺Т-клетками (91,31% (88,27-93,65) против 65,31% (27,08-75,00) и 90,80% (37,92-96,08) против 99,24% (96,38- 99,83) соответственно, при p < 0,001 в случае обеих молекул) (рис. 2А, Б). Данные изменения могут возникать вследствие преобладания клеток эффекторной памяти в пуле CD8^dimCD4^brightТ-лимфоцитов, так как эти субпопуляции могут высоко экспрессировать CD27 для поддержания выживания и снижать экспрессию костимуляционного рецептора CD28 после контакта с антигеном. Стоит отметить, что CD57 также отражает содержание гранул перфорина и гранзима внутри клетки, поэтому увеличение экспрессии этого маркера на поверхности CD8^dimCD4^brightT-клеток может свидетельствовать о приобретении ими цитолитических свойств. Эти результаты согласуются с данными, полученными Nascimbeni M. и соавт., однако исследователи связывают повышение экспрессии CD57 только с терминальной дифференцировкой и репликативным старением CD8^dimCD4^brightT-клеток [8].

Рисунок 2. Экспрессия CD27, CD28 и CD57 субпопуляциями Т-лимфоцитов с различными паттернами экспрессии маркеров CD4 и CD8. Примечание. Гистограммы А-Е показывают относительное содержание CD3⁺CD4⁺, CD8^dimCD4^bright, CD3⁺CD8⁺ и CD4^dimCD8^bright, экспрессирующих маркеры CD27, CD28 и CD57 соответственно. Черные кружки обозначают клетки CD3⁺CD4⁺ и CD3⁺CD8⁺ на гистограммах А-В и Г-Е соответственно, белые кружки – клетки CD8^dimCD4^bright и CD4^dimCD8^bright на гистограммах А-В и Г-Е соответственно. Результаты представлены в виде медианы и интерквантильного размаха – Me (Q_0,25-Q_0,75); для полученных сравнения выборок использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни.

В свою очередь, CD4^dimCD8^brightТ-лимфоциты на своей поверхности увеличивают экспрессию CD28 (92,23% (77,94-96,83) против 65,67% (54,43-81,20) на поверхности CD8⁺Т-клеток при p < 0,001) (рис. 2Д), а также характеризуются сниженной экспрессией CD57 (7,14% (2,08-14,71) против 23,22% (10-33,17) на поверхности CD8⁺Т-клеток при p < 0,001) (рис. 2Е). Marrero Y.T. и соавт. также было показано увеличение экспрессии CD28 на поверхности CD4^dimCD8^brightТ-лимфоцитов [7]. Более того, данная субпопуляция могла продуцировать высокие уровни IL-4 и IFNγ [7], что косвенно может отражать снижение цитолитического потенциала в пользу цитокин-секретирующего. Экспрессия CD27 между CD4^dimCD8^brightТ-лимфоцитами и CD8⁺Т-клетками не отличалась (81,69% (71,88-89,80) против 76,27% (61,96-89,25) соответственно, при р = 0,227) (рис. 2Г). По-видимому, увеличение экспрессии CD28 с одновременным снижением CD57 было связано с преобладанием пула центральной памяти среди CD4^dimCD8^brightT-клеток, что также связано с отсутствием цитолитических свойств у данной популяции клеток и сниженным уровнем CD57⁺ клеток.

Выводы

DP Т-клетки обладают преимущественно фенотипом памяти: CD8^dimCD4^bright клетки с преобладанием эффекторной памяти, CD4^dimCD8^bright клетки с преобладанием центральной. На поверхности субпопуляции CD8^dimCD4^brightT-клеток по сравнению с CD4⁺Т-лимфоцитами увеличивается экспрессия CD27 и CD57, в то время как экспрессия CD28 снижается, что также характеризует эффекторный фенотип памяти и приобретение цитолитической способности. На поверхности CD4^dimCD8^brightТ-лимфоцитов по сравнению с CD8⁺Т-лимфоцитами увеличивается экспрессия CD28 и снижается экспрессия CD57, в то время как экспрессия CD27 статистически значимо не отличается, что также характерно для клеток памяти, преобладавшей в этой субпопуляции. Для более детальной характеристики фенотипа DP Т-клеток необходимы дальнейшие исследования.

Об авторах

Артем Аркадьевич Рубинштейн

Автор, ответственный за переписку.
Email: arrubin6@mail.ru

врач общей практики, младший научный сотрудник лаборатории клеточной иммунологии

Список литературы

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

2. Рисунок 1. Распределение основных субпопуляций Т-лимфоцитов в зависимости от экспрессии CD62L и CD45RA. Примечание. Круговые диаграммы А-Г показывают относительное количество лимфоцитов с фенотипом «наивных» клеток (CD45RA+CD62L+) – белый цвет, клеток центральной памяти (CM, CD45RA-CD62L+) – серый цвет, клеток эффекторной памяти (EM, CD45RA-CD62L-) – темно-серый цвет и терминально дифференцированных CD45RA-позитивных эффекторных клеток памяти (CD45RA+CD62L-) – черный цвет. Круговая диаграмма А показывает распределение фенотипов среди CD3+CD4+, диаграмма Б – среди CD8dimCD4bright, диаграмма В – относительно CD3+CD8+ и диаграмма Г – распределение фенотипов среди CD4dimCD8bright. 

Скачать (136KB)

Метаданные

3. Рисунок 2. Экспрессия CD27, CD28 и CD57 субпопуляциями Т-лимфоцитов с различными паттернами экспрессии маркеров CD4 и CD8. Примечание. Гистограммы А-Е показывают относительное содержание CD3+CD4+, CD8dimCD4bright, CD3+CD8+ и CD4dimCD8bright, экспрессирующих маркеры CD27, CD28 и CD57 соответственно. Черные кружки обозначают клетки CD3+CD4+ и CD3+CD8+ на гистограммах А-В и Г-Е соответственно, белые кружки – клетки CD8dimCD4bright и CD4dimCD8bright на гистограммах А-В и Г-Е соответственно. Результаты представлены в виде медианы и интерквантильного размаха – Me (Q0,25-Q0,75); для полученных сравнения выборок использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни.

Скачать (331KB)

Метаданные