Функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов как ранний маркер инфекционного воспаления при остром панкреатите

Полный текст

Введение

Принято считать, что острый панкреатит (ОП) – это первоначально асептическое воспаление поджелудочной железы. Однако экстренно поступающие пациенты с ОП могут иметь как сопутствующие очаги инфекции, так и ассоциированные с поджелудочной железой. Известно, что преобладающими и немедленно реагирующими эффекторами острого воспаления являются нейтрофильные гранулоциты (НГ) [2, 4]. Можно предположить, что реакция гранулоцитов на асептическое или инфекционное воспаление может быть отличной. Нейтрофильные гранулоциты обладают рядом свойств, обусловливающих их участие в патогенезе острого воспаления: богатый набор цитотоксических факторов; высокая чувствительность к всевозможным локальным изменениям гомеостаза; способность накапливаться в очагах поражения и инициировать цепную реакцию с выделением цитотоксических веществ, секретировать биологически активные вещества, активирующие предшественников медиаторов воспаления. Гранулоциты участвуют в реализации иммунокомплексных повреждений тканей и в антителозависимых цитотоксических реакциях [3]. В связи с этим оценка различных характеристик функций нейтрофильных гранулоцитов позволит определить ранние биомаркеры бактериальной инфекции и осуществлять скрининг наличия воспаления, ассоциированного с инфекцией.

Цель исследования состояла в определении функциональных характеристик нейтрофильных гранулоцитов как ранних биомаркеров инфекционного процесса при остром панкреатите.

Материалы и методы

Проведено обследование и анализ течения заболевания у 95 пациентов, последовательно поступивших в городской панкреатологический центр ГБУ СПб НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе с диагнозом «острый панкреатит» с декабря 2022 года по март 2024 года. Критерии включения: возраст 20-80 лет, время от первых симптомов заболевания до поступления в стационар не более 48 часов; критерии исключения – наличие гепатитов В и С, ВИЧ, наркозависимости, онкологических и аутоиммунных заболеваний. Тяжесть ОП определяли по шкале первичной экспресс-оценки тяжести острого панкреатита СПб НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе [1] с выделением легкой, средней и тяжелой степени. Венозную кровь исследовали в 1-е, 3-и и 10-е сутки от момента госпитализации. Оценивали количество гранулоцитов и индекс реактивности гранулоцитов (Neut-RI, IF) методом проточной цитометрии (Sysmex XN1000), являющийся компонентом общего клинического анализа крови, относительное и абсолютное количество CD14+ нейтрофильных гранулоцитов (CD14+НГ) (иммуноцитохимический метод, МКА Dako, система визуализации Novocastra), содержание в сыворотке крови растворимых рецепторов CD14 (sCD14) (иммуноферментный метод (ИФА), Elabscience) и растворимого антимикробного пептида гранулоцитов – растворимого α-дефенсина (HNP 1-3, sDef) (ИФА, Elabscience). Дополнительно анализировали содержание в крови биомаркеров системного воспаления и бактериальной инфекции интерлейкина-6 (IL-6) (иммунохемилюминесцентный метод, ECL 8000, Lifotronic) и прокальцитонина (иммунохемилюминесцентный метод, Architect i2000, Abbot).

Наличие или отсутствие бактериальных локальных и/или системных процессов или осложнений ОП, других осложнений определяли в ходе клинического наблюдения и анализа данных историй болезни. Наличие инфекции, ассоциированной с поджелудочной железой, определяли при анализе данных бактериологического исследования и ДНК-диагностики внутриклеточных инфекционных агентов (CFX96, AmpliSens); наличие бактериемии – по результатам посева крови, наличие очагов инфекции иной локализации – по результатам лучевой диагностики, исследований мочи, бронхиального секрета, мокроты и др.

Статистический анализ проведен с помощью программы StatTech v. 4.6.1 (ООО «Статтех», Россия). Количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению (критерии Шапиро–Уилка и Колмогорова–Смирнова), описывали с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q0,25-Q0,75). Сравнение по количественному показателю выполняли с помощью U-критерия Манна–Уитни, направление и тесноту корреляционной связи между показателями оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Прогностическая модель, характеризующая зависимость количественной переменной от факторов, разрабатывалась с помощью метода линейной регрессии. Для оценки диагностической значимости количественных признаков применяли метод анализа ROC-кривых; разделяющее значение количественного признака в точке cut-off определяли по наивысшему значению индекса Юдена. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Общая характеристика больных, частота инфекционных событий, тяжесть и исход заболевания представлены в таблице 1. Анализ частоты выявления очаговой или системной инфекции показал, что количество их ассоциировано с тяжестью острого панкреатита (умеренная теснота связи r = 0,342, p = 0,007).

 

Таблица 1. Общая характеристика больных с острым панкреатитом различной степени тяжести

Table 1. General characteristics of patients with acute pancreatitis of varying severity

Группы больных Groups of patients	Количество Quantity	Возраст (годы) Age (years)	Индекс коморбидности (баллы) Comorbidity index (points)	Наличие очагов инфекции или сепсиса Presence of foci of infection or sepsis	Исход Issue
					Выжили They survived	Умерли They died
	n	Me (Q0,25-Q0,75)	Me (Q0,25-Q0,75)	n, %	n, %	n, %
Легкой степени Mild degree	32	60 (43-71)	3 (2-5)	9 (28%)	32 (100%)	0
Среднетяжелый Medium-heavy	25	44 (39-66)	3 (2-4)	17 (68%)	25 (100%)	0
Тяжелый Heavy	39	41 (36-50)	4 (2-6)	33 (85%)	25 (64%)	14 (36%)
Всего Only	95	47 (36-51)	3 (2-5)	54 (57%)	81 (83%)	14 (17%)

Примечание. В группе больных c ОДП средней тяжести развился сепсис у 1 больного, в группе больных с тяжелым ОДП – у 17 (44%).

Note. In the group with moderate AP, sepsis developed in 1 patient, in the group with severe AP – in 17 patients (44%).

 

Представленные в таблице сведения подтверждают, что лечение острого деструктивного панкреатита (ОДП) остается актуальной проблемой, прежде всего ОП тяжелой степени, которые сопровождаются высокой летальностью и развиваются преимущественно у лиц молодого и среднего возраста [7, 8].

Результаты анализа функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов представлены в таблице 2.

 

Таблица 2. Функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов крови пациентов с острым панкреатитом различной тяжести

Table 2. Functional activity of neutrophil granulocytes in the blood of patients with acute pancreatitis of varying severity

Показатели Indicators	Сроки наблюдения (дни) Observation period (days)	Категории Categories		p
		Отсутствие инфекции No infection	Наличие инфекции Presence of infection
		Me (Q0,25-Q0,75) M±SD (95% ДИ)	Me (Q0,25-Q0,75) M±SD (95% ДИ)
Количество НГ 2,7 (2,2-3,1) 109/л Number of NG 2.7 (2.2-3.1) 109/L	1	11,2 (7,9-15,3) n = 42	11,4 (8,8-14,1) n = 48	0,821
	3	7,0 (4,0-11,0) n = 38	8,8 (5,0-11,5) n = 32	0,260
	10	5,1 (3,9-7,3) n = 26	9,6 (4,6-14,6) n = 31	0,012*
Реактивность НГ (Neut-RI) 44,8 (42,1-45,7) ИФ Granulocyte reactivity (Neut-RI) 44.8 (42.1-45.7) FI	1	47,90 (45,6-49,9) n = 37	51,25 (48,70-57,12) n = 40	< 0,001*
	3	47,6 (45,30-49,15) n = 35	55,75 (49,62-65,22) n = 44	< 0,001*
	10	47,13±2,67 (95% ДИ 46,1-48,2) n = 26	50,47±4,72 (95% ДИ 48,6-52,3) n = 28	< 0,003*
CD14+НГ 1,2 (0,5-1,4) 109/л CD14+NG 1.2 (0.5-1.4) 109/L	1	3,33 (2,17-4,56) n = 37	3,61 (2,72-4,96) n = 33	0,356
	3	2,17 (1,23-3,00) n = 39	2,68 (1,78-5,04) n = 39	0,100
	10	1,33 (0,71-2,17) n = 28	3,22 (1,24-5,40) n = 26	0,002*
sCD14 1,14 (1,14-1,16) мкг/мл sCD14 1.14 (1.14-1.16) mсg/mL	1	2,9 (1,82-3,77) n = 29	3,82 (3,04-5,38) n = 27	0,004*
	3	3,58 (2,16-5,69) n = 31	4,74 (3,51-6,82) n = 35	0,044*
	10	3,49±2,29 (2,48-4,50) n = 22	4,5±2,35 (3,46-5,54) n = 22	0,157
sDef 5,4 (3,7-6,7) нг/мл sDef 5.4 (3.7-6.7) ng/mL	1	19,5 (7,4-36,2) n = 37	43,7 (19,4-102,2) n = 36	0,014*
	3	15,8 (7,3-31,4) n = 36	36,1 (22,1-71,4) n = 36	0,007*
	9-10	10,4 (5,0-33,4) n = 26	46,3 (16,6-111,3) n = 30	0,012*

Примечание. * – различия между показателями у больных c отсутствием или наличием инфекции в течение госпитализации значимы (p < 0,05). ИФ – интенсивность флюоресценции.

Note. *, the differences between the indicators in patients with absence or presence of infection during hospitalization are significant (p < 0.05). FI, fluorescence intensity

 

При сравнении количества НГ мы наблюдали статистически значимые различия между показателями у пациентов с отсутствием или наличием инфекции только на 10-е сутки после поступления в стационар (p = 0,012, U-критерий Манна–Уитни) (табл. 2). В этой точке количество НГ приобретало статистическую значимость как предиктор инфекционных осложнений (AUC = 0,694; 95% ДИ: 0,557-0,830, p = 0,012) с пороговым значением количества НГ в точке cut-off 8,2 × 109/л. Наличие инфекции прогнозировалось при количестве гранулоцитов выше данной величины или равном ей. Чувствительность и специфичность прогностической модели составили 58,1% и 88,5% соответственно.

Анализ реактивности нейтрофильных гранулоцитов (Neut-RI), определяемой по уровню хемилюминесценции НГ, показал, что во все сроки наблюдения более высокие значения показателя выявили у больных с наличием очагов инфекции или сепсиса (p < 0,001, p < 0,001, p = 0,003 соответственно; U-критерий Манна–Уитни в двух случаях и t-критерий Стьюдента (табл. 2). Пороговое значение реактивности нейтрофилов в точке cut-off в 1-е сутки госпитализации составило 49,1 IF с чувствительностью 62,5% и специфичностью 67,6%.

CD14 представляет собой рецептор, закрепленный на гликозилфосфатидилинозитоле (GPI), который служит корецептором для нескольких Toll-подобных рецепторов (TLR) как на поверхности клетки, так и в эндосомальном компартменте. CD14 может экспрессироваться клетками как гемопоэтического, так и негемопоэтического происхождения в виде рецептора клеточной мембраны или секретируемого белка [3, 9]. Большая часть доступной информации касается роли CD14 как корецептора, взаимодействующего с TLR4 и облегчающего клеточные реакции на низкие дозы липополисахарида (ЛПС). CD14 вместе с TLR4 и MD-2 образует мультирецепторный комплекс, который распознает липополисахариды на клеточной мембране. Важная защитная роль CD14 была установлена при некоторых формах кишечных инфекций, в то время как при легочных инфекциях были описаны как положительные, так и отрицательные эффекты в зависимости от возбудителя [9]. Возможно, исследование как мембранного рецептора CD14, так и растворимой его формы (sCD14) откроет новое в патогенезе острого панкреатита.

При оценке количества CD14+НГ × 109/л в крови в зависимости от наличия или отсутствия инфекционных осложнений были выявлены существенные различия (p = 0,002) только на 10-е сутки от начала заболевания (U-критерий Манна–Уитни) (табл. 2). Полученная модель приобретала высокую статистическую значимость (площадь под ROC-кривой 0,745±0,068 с 95% ДИ: 0,612-0,878; р = 0,002). Пороговое значение количества CD14+НГ в точке cut-off составило 2,49 × 109/л для риска развития инфекции. Чувствительность и специфичность модели составили 65,4% и 85,7% соответственно. Также на 10-е сутки наблюдения количество CD14+НГ значимо коррелировало с исходом заболевания по критерию «выжил-умер» (р = 0,034, коэффициент Спирмена).

В ходе исследования содержания в сыворотке крови растворимого CD14 (sCD14) в 1-е (p = 0,004) и 3-и (p = 0,044) сутки заболевания были выявлены статистически значимые различия показателя у больных с отсутствием или наличием бактериальной инфекции. Площадь под ROC-кривой составила 0,724±0,068 с 95% ДИ 0,590-0,858; полученная модель была статистически значимой (p = 0,004). Пороговое значение sCD14 в точке cut-off составило 3,28 мкг/мл, чувствительность – 70,4% и специфичность – 69,0%.

Нейтрофильные гранулоциты при острых и хронических воспалительных процессах быстро мигрируют в очаги воспаления, в регионарные лимфатические узлы и селезенку, где они секретируют биологически активные вещества, обладающие антимикробными, противогрибковыми и противовирусными свойствами, а также способные модулировать функции В- и Т-лимфоцитов [6], реакции гомеостаза при патологических процессах [5]. К числу таких факторов, секретируемых гранулоцитами, относятся дефенсины. При анализе содержания в крови растворимого дефенсина человека были установлены статистически значимые различия концентраций пептида у пациентов c наличием или отсутствием бактериальной инфекции в 1-е, 3-и и 10-е сутки наблюдения (p = 0,014, p = 0,007, p = 0,012 соответственно). Пороговое значение показателя в точке cut-off для инфекции 28,4 нг/ мл, чувствительность – 58,3%, специфичность – 59,5%. Площадь под ROC-кривой составила 0,667±0,063 с 95% ДИ: 0,542-0,791. Полученная модель была статистически значимой (p = 0,014).

Выводы

1. Тяжесть острого панкреатита связана с наличием очаговой и/или системной бактериальной инфекции.
2. Показатели, отражающие воспалительную активность нейтрофильных гранулоцитов – реактивность гранулоцитов (Neut-RI), уровни растворимых дефенсинов NHP1 и CD14 – позволяют в первые часы от момента поступления пациента в стационар определить наличие и/или риск развития локальной или системой бактериальной инфекции.
3. Показатель реактивности гранулоцитов (Neut-RI) является доступным экспресс-тестом для выявления инфекционного компонента воспаления при остром панкреатите.

Об авторах

Л. П. Пивоварова

ГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи имени И.И. Джанелидзе»

Email: olga.ariskina@mail.ru

д.м.н., руководитель отдела лабораторной диагностики

Россия, Санкт-Петербург

О. Б. Арискина

ГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи имени И.И. Джанелидзе»

Автор, ответственный за переписку.
Email: olga.ariskina@mail.ru

к.б.н., научный сотрудник отдела лабораторной диагностики

Россия, Санкт-Петербург

И. В. Осипова

ГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи имени И.И. Джанелидзе»

Email: olga.ariskina@mail.ru

кандидат мед.наук, старший научный сотрудник отдела лабораторной диагностики

Россия, Санкт-Петербург

А. Е. Демко

ГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи имени И.И. Джанелидзе»

Email: olga.ariskina@mail.ru

д.м.н., профессор, заместитель директора по научной работе, руководитель отдела гепатохирургии

Россия, Санкт-Петербург

А. А. Рысева

ГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи имени И.И. Джанелидзе»

Email: olga.ariskina@mail.ru

врач клинической лабораторной диагностики лаборатории иммунологии

Россия, Санкт-Петербург

М. И. Громов

ГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи имени И.И. Джанелидзе»

Email: olga.ariskina@mail.ru

д.м.н., руководитель отдела эфферентной терапии

Россия, Санкт-Петербург

В. М. Малькова

ГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи имени И.И. Джанелидзе»

Email: olga.ariskina@mail.ru

врач-хирург, младший научный сотрудник отдела гепатохирургии

Россия, Санкт-Петербург

Е. В. Маркелова

ГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи имени И.И. Джанелидзе»

Email: olga.ariskina@mail.ru

врач клинической лабораторной диагностики клинико-диагностической лаборатории

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы