Активность новых гибридных синтетических противоопухолевых пептидов CaBuCr и CaLTX in vivo в модели асцитной карциномы Эрлиха мыши

Полный текст

Введение

Некоторые эффекторные пептиды системы врожденного иммунитета, также известные как катионные антимикробные пептиды (АМП), способны избирательно распознавать и нарушать структуру мембран не только бактерий, но и опухолевых клеток за счет повышенного содержания в них электроотрицательных компонентов (фосфатидилсерина, сиалированных гликолипидов и гликопротеинов и др.), большей площади поверхности и, зачастую, сниженного содержания холестерина [6]. Поскольку в противовес большинству применяемых химиопрепаратов принцип действия таких пептидов напрямую не связан с темпами деления клетки, они рассматриваются как перспективные кандидаты для пополнения арсенала противоопуолевых агентов, потенциально эффективные против обладающих лекарственной устойчивостью клеток, например присутствующих в опухоли персистирующих клеток с низкой метаболической активностью [2, 6]. Ранее нами был синтезирован набор гибридных противоопухолевых АМП на основе богатых пролином, триптофаном или лейцином последовательностей. По результатам тестирования in vitro в отношении 6 линий опухолевых и 2 типов нетрансформированных клеток среди них было выделено несколько перспективных пептидов-прототипов по сочетанию высокой активности и селективности цитотоксического действия против опухолевых клеток, а также низкой гемолитичности. Наибольший интерес представляли пептиды на остове N-концевого фрагмента (1-8) АМП цекропина А CaBuCr и CaLTX. В случае CaBuCr C-концевая часть была представлена регуляризованной пролин- и триптофан-богатой последовательностью кателицидина 4 азиатского буйвола buCATHL4D с частичной заменой остатков аргинина остатками лизина. В случае CaLTX использовали последовательность с повторами 2 лизина через 2 триптофана, сходную с последовательностью известного противоопухолевого синтетического пептида LTX-315 за исключением замены непротеиногенной аминокислоты остатком триптофана. Основным отличием между пептидами, по данным in vitro, был индекс селективности действия против опухолевых клеток в сравнении с нормальными, который для CaBuCr более чем в 2 раза превышал аналогичный показатель CaLTX.

Целью текущего исследования была проверка противоопухолевых свойств данных синтетических гибридных пептидов в условиях in vivo против экспериментально индуцированной опухоли у животных, в качестве которой была выбрана модель асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) мыши.

Материалы и методы

Пептиды были получены методом твердофазного химического синтеза в автоматическом режиме с использованием пептидного синтезатора Symphony X (Protein Technologies inc, США) с инфракрасным нагревом до 70 °С на этапе конденсации. Применяли стандартную схему с Fmoc/ tBu защитами; использовали Fmoc-защищенные аминокислоты производства Iris Biotech GmbH, Германия; в качестве полимера-носителя выступала 2-хлортритил хлоридная смола.

Анализ и очистку синтезированных аминокислотных последовательностей осуществляли методом обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) с использованием хроматографической системы NGC Chromatography System Quest 10 Plus (Bio-Rad, США). При препаративной ОФ-ВЭЖХ разделение проводили на колонке Waters Symmetry (С-18, 19 × 300 мм, 7 мкм, Waters Corp, США), элюирование происходило в градиенте 5 → 70% вода → ацетонитрил в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ) за 60 минут. При аналитической ОФ-ВЭЖХ использовали колонку Luna (С-18, 4,6 × 250 мм, 5 мкм, Phenimenex, США) и элюировали пептиды в градиенте 5 → 60% вода → ацетонитрил в присутствии 0,1% ТФУ за 15 минут. Соответствие расчетной молекулярной массе подтверждали методом времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI TOF) на приборе MALDI TOF Ultraflex (Bruker, США). Чистота препаратов составила 95% для CaBuCr и 99% для CaLTX.

Цитотоксическую активность пептидов в отношении клеток АКЭ мыши предварительно оценивали в условиях in vitro в классическом МТТ-тесте [7]. Культуру карциномы Эрлиха поддерживали переносом 5 млн клеток, полученных из асцитной жидкости животного с опухолью, следующему животному каждые 10 дней. Клетки вводили интраперитонеально в 0,4 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР). Для экспериментов клетки дважды отмывали в стерильном ЗФР: осаждали 10-минутным центрифугированием при 300 g и 4 °С и освобождали от супернатанта. В случае МТТ-теста клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 (Биолот, Россия) и распределяли по 30 тыс. в лунки тестового 96-луночного планшета для суспензионных культур, куда затем вносили двукратные серийные разведения пептидов в 3 повторностях. Данные о проценте клеточной гибели в пробах в сравнении с контролем интактных клеток аппроксимировали стандартной S-образной кривой с 4 параметрами и вычисляли 50% ингибирующие концентрации (ИК₅₀) с использованием программного пакета SigmaPlot 11.0.

Для моделирования опухолевого процесса in vivo использовали самцов мышей гибридов 1-го поколения CBA × С57BL/6 в возрасте 3-4 мес, средней массой 23 ± 2 г, из питомника «Рапполово» (Санкт-Петербург, Россия). Развитие опухоли инициировали интраперитонеальной инъекцией 1 млн клеток АКЭ в 0,4 мл ЗФР в 0-й день эксперимента. Ежедневно, с 1-го до 10-го дня, животным также интраперитонеально вводили по 30 мкг пептидов (1,3 мг/кг в пересчете на вес) в 0,1 мл ЗФР; контрольной группе вводили 0,1 мл ЗФР без пептидов. Экспериментальные и контрольная группы насчитывали по 13 животных. В 0-й, 6-й и 11-й день проводили контрольные взвешивания. На 11-й день 3 мышей из каждой группы подвергали эвтаназии и лапаротомии, тщательно отбирали всю асцитную жидкость, измеряли ее объем, подсчитывали в камере Горяева концентрацию клеток АКЭ в образцах. Перед эвтаназией проводили также забор крови из кончика хвоста для определения количества лейкоцитов: 10 мкл цельной крови добавляли к 190 мкл раствора 5% уксусной кислоты, подкрашенного метиленовым синим. Смесь перемешивали и наносили образец на камеру Горяева. Подсчет проводили в 100 больших квадратах. По данным наблюдений за оставшимися 10-ю животными каждой группы строили кривые выживаемости Каплана–Мейера.

Животные содержались на стандартном рационе со светотемновым циклом 12:12 ч, температурой 23 ± 2 °С и доступом к еде и воде ad libitum в условиях вивария. Работы проводились в соответствии с ГОСТ 33215-2014 и 33216-2014 и СанПин 2.2.1.3218–14, регламентирующими правила обращения с лабораторными животными, и положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях». Экспериментальные процедуры осуществляли согласно протоколу 1/20 от 27.02.2020, утвержденному локальным этическим комитетом ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины».

Сравнение экспериментальных групп с контрольной по численным параметрам проводили с использованием U-критерия Манна–Уитни; при сравнении данных выживаемости использовали логарифмический ранговый тест.

Результаты и обсуждение

Было выявлено, что в условиях in vitro оба рассматриваемых синтетических гибридных пептида оказывают выраженное цитолитическое действие на клетки АКЭ, сравнимое с эффектом высокоактивного мембранолитического β-шпилечного АМП свиньи протегрина 1. По результатам трех независимых экспериментов ИК₅₀ CaLTX составила 2,6 ± 0,3 мкМ, а ИК₅₀ CaBuCr – 2,9 ± 0,4 мкМ, что статистически не отличается от ранее опубликованной ИК₅₀ протегрина 1, равной 2,9 ± 0,3 мкМ [1]. При этом прямая цитотоксическая активность данных линейных пептидов, обогащенных триптофаном в случае CaLTX или триптофаном и пролином в случае CaBuCr, более выражена, чем у обогащенного пролином линейного пептида бактенецина СhBac3.4 (ИК₅₀ 13,3 ± 0,2 мкМ [1]), для которого была показана противоопухолевая активность против солидной карциномы Эрлиха in vivo [4].

У мышей с асцитной опухолью, индуцированной введением клеток АКЭ, 10-дневный курс ежедневных интраперитонеальных инъекций как CaBuCr, так и CaLTX положительно сказывался на продолжительности жизни (рис. 1). В сравнении с контрольной группой, где средняя продолжительность жизни животных с опухолью составила 19,8 ± 2,5 суток (медиана 20,5 суток), в группе, получавшей CaBuCr, данный показатель увеличился на 24,2% и был равен 24,6 ± 4,6 суток (медиана 25 суток). CaLTX показал несколько меньшие результаты: продолжительность жизни мышей, получавших данный пептид, со дня индукции опухоли составляла 22,4 ± 2,8 суток (медиана 22,5 суток), на 13,1% больше, чем у контрольных. Исследование животных, выведенных из эксперимента по окончании курса введения пептидов, показало, что к 11-му дню в контрольной группе объем асцитной жидкости у животных достигал 7,0 ± 0,5 мл, общее число клеток в асците – 2,3 ± 0,1 млрд, а их концентрация составляла (3,3 ± 0,2) × 10⁸ клеток/мл (рис. 1). Введение CaLTX значимо снижало объем асцита до 5,7 ± 0,6 мл (на 19 ± 9%), концентрацию клеток до (2,3 ± 0,4) × 10⁸ клеток/мл (на 30 ± 13%) и их общее число до 1,3 ± 0,3 млрд (на 43 ± 12%). Введение CaBuCr существенно не сказывалось на объеме асцита (6,9 ± 1,1 мл), но более выражено снижало концентрацию клеток ((1,8 ± 0,1) × 10⁸ клеток/ мл, на 46 ± 4% меньше, чем в контроле), так что в конечном итоге эффект на общее число клеток был практически аналогичен действию второго пептида: в группе, получавшей CaBuCr, оно составило 1,2 ± 0,2 млрд клеток (на 47 ± 7% меньше, чем в контроле). Кроме того, в крови мышей экспериментальных групп заметно повышалось количество лейкоцитов: при введении CaBuCr данный показатель составил (7,1 ± 0,2) × 10⁶ клеток/ мл, при введении CaLTX – (8,4 ± 0,8) × 10⁶ клеток/ мл, а в контрольной группе всего (4,6 ± 0,5) × 10⁶ клеток/мл (рис. 1). В то же время ни CaBuCr, ни CaLTX не оказывали статистически значимого влияния на динамику набора веса животными (рис. 1).

 

Рисунок 1. Эффекты гибридных пептидов CaBuCr и СaLTX в модели асцитной карциномы Эрлиха мыши

Примечание. * – статистически значимое отличие от контрольной группы; р = 0,05, если не указано иное.

Figure 1. Effects of hybrid peptides CaBuCr and CalTX in the murine Ehrlich ascites carcinoma model

Note. *, statistically significant difference from the control group; p = 0.05 unless otherwise specified.

 

Известно, что пептид цекропинXJ при такой же схеме введения в дозе 5 мг/кг (115 мкг в пересчете на мышь весом 23 г) в модели гетерологичного асцита, вызванного введением мышам линии BALB/C клеток рака желудка человека BGC823, способствовал снижению объема асцита в 2 раза и повышению продолжительности жизни животных на 66% в сравнении с контрольной группой, получавшей 5 мг/кг бычьего сывороточного альбумина [8]. N-концевой участок цекропинаXJ гомологичен использованному при конструировании гибридных пептидов N-концевому фрагменту цекропина А (1-8) за исключением отсутствия первого лизина и замены в положении 4 лейцина изолейцином. С учетом отличий дозировки и характера опухоли можно счесть эффекты новых синтетических химерных пептидов сходными с эффектом цекропина XJ. В то же время при исследовании действия протегрина 1 в модели АКЭ, аналогичной использованной в текущем исследовании, интраперитонеальное введение пептида в дозах от 20 до 80 мкг (от 0,8 до 3,2 мг/кг) на 1-й, 3-й и 5-й день после инокуляции опухоли (в 0-й день) приводило к более чем 50% снижению числа клеток в асците к 10-м суткам, однако никак не влияло на продолжительность жизни животных [1]. Подобную разницу в эффектах можно отчасти отнести к меньшей частоте введения протегрина, поскольку пептидные препараты высоко подвержены протеолитической деградации в организме, хотя β-шпилечные пептиды в целом более устойчивы к действию протеаз, чем линейные. Однако более редкое и непродолжительное введение протегрина влияет на общую численность клеток АКЭ более выражено, чем десятидневный курс CaBuCr или CaLTX. При этом, на фоне схожести эффекта на численность клеток АКЭ к 10–11 суткам и цитотоксической активности in vitro всех трех пептидов, в случае протегрина не наблюдается увеличения продолжительности жизни животных in vivo. Это заставляет предположить, что важным в реализации противоопухолевых свойств пептидов является не только непосредственное цитотоксическое воздействие на клетки опухоли, но и сопутствующие реакции иммунной системы, которые также могут зависеть от частоты введения пептида. Известно, что действие цитолитических пептидов сопровождается высвобождением ассоциированных с повреждением молекулярных паттернов (DAMP), или аларминов, из опухолевых клеток, что приводит к активации противоопухолевого клеточного иммунитета [5]. Отражением данного механизма может быть, в частности, наблюдаемое повышение содержания лейкоцитов в крови животных, получавших пептиды. Кроме того, для некоторых пептидов, например синтетического пептида LTX-315 [5] или β-дефенсина человека hBD3 [3], показаны прямые модулирующие эффекты на дендритные клетки. В связи с этим различия в выраженности влияния CaBuCr и CaLTX на продолжительность жизни мышей с АКЭ могут быть связаны не только с предположительно меньшей, по данным in vitro, избирательностью действия CaLTX в отношении именно опухолевых клеток, но и с индивидуальными особенностями иммуномодулирующих свойств данных пептидов.

Заключение

Таким образом, оба новых гибридных пептида, CaBuCr и СaLTX, проявляют противоопухолевую активность in vivo против модельной АКЭ у мышей: снижают численность клеток опухоли и увеличивают продолжительность жизни животных – и являются перспективными для продолжения разработки противоопухолевых комбинаций на их основе. При этом, несмотря на сходство эффектов пептидов в отношении клеток АКЭ в культуре, in vivo действие CaBuCr более выражено, что указывает на влияние дополнительных факторов, помимо прямой цитотоксичности.

В целом следует отметить, что увеличение срока выживаемости при повышении длительности курса и частоты введения, наблюдаемое в сравнении с предыдущими экспериментами с пептидом PG-1 в той же модели, подкрепляет идею о том, что модификации для повышения протеолитической стабильности способны усилить противоопухолевый потенциал пептидов in vivo. В то же время необходимо учесть и подробно изучить иммуномодулирующие возможности противоопухолевых АМП: как с целью лучшего понимания механизма реализации их свойств, так и для осуществления удачной модификации, например, при использовании D-аминокислот.

Об авторах

М. С. Жаркова

Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: zharkova.ms@yandex.ru

к.б.н., заведующая лабораторией противоопухолевых пептидных препаратов

Россия, Санкт-Петербург

А. Е. Рудель

Институт экспериментальной медицины

Email: zharkova.ms@yandex.ru

младший научный сотрудник лаборатории противоопухолевых пептидных препаратов

Россия, Санкт-Петербург

А. С. Дятлова

Институт экспериментальной медицины

Email: zharkova.ms@yandex.ru

научный сотрудник лаборатории противоопухолевых пептидных препаратов

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы