Внеклеточная ДНК в крови мышей при Th1- и Th2-зависимом варианте развития хронической реакции «трансплантат против хозяина»

Полный текст

Научное исследование проведено с использованием денежных средств государственного задания (регистрационная карта № 124112700049-9).

Введение

Ранее нами было обнаружено, что концентрация внеклеточной ДНК (вкДНК) в плазме крови больных с бронхиальной астмой (БА) снижена по сравнению с ее содержанием в крови условно здоровых доноров [3], в отличие от повышения ее уровня, показанного при других патологических состояниях [1, 2]. В этом отношении пациенты с БА радикально отличаются от параллельно обследованной нами группы больных, страдающих ревматоидным артритом (РА), у которых данный показатель существенно повышен по сравнению со здоровыми лицами, и его повышение тесно связано со степенью выраженности патологического процесса у индивидуальных больных. Поскольку, согласно общепринятым сегодня представлениям, патогенез РА в значительной степени определяется Th1-зависимыми иммунными реакциями, а в развитии клинической картины БА основную роль играют Th2-зависимые иммунные процессы, естественно предположить, что наблюдаемое у пациентов с РА увеличение концентрации вкДНК в плазме крови может быть связано с преобладанием при этом заболевании эффектов, вызываемых активностью хелперов первого типа. С другой стороны, исследованные группы пациентов с БА и РА резко отличаются по степени выраженности у них системного воспаления. Если при РА содержание в крови С-реактивного белка (СРБ) – базового показателя активности воспалительных процессов – составляло в среднем 17,5 мг/мл (в норме до 5 мг/мл), то при БА лишь у отдельных больных концентрация СРБ выходила за границы нормы, а в среднем составляла 2,5 мг/ мл. Таким образом, отличия в уровнях вкДНК у больных БА и РА могут также объясняться воздействием на величину этого параметра неких факторов, непосредственно связанных с механизмами развития воспалительных процессов. В пользу этого предположения говорит и тот факт, что у больных РА содержание вкДНК в плазме крови положительно коррелирует с показателями воспалительной активности [4], причем эта связь подтверждается и данными других авторов [5].

В настоящее время конкретные патофизиологические механизмы, обусловливающие изменения концентрации вкДНК в крови при различных заболеваниях, еще не выяснены, и выбор между указанными причинами ее оппозитных значений при БА и РА может быть лишь предположительным. Целью данной работы являлось изучение возможного влияния Th1/Th2-баланса на уровень внеклеточной ДНК в крови экспериментальных животных в модельной системе развития хронической реакции «трансплантат против хозяина» (хРТПХ).

Как давно было установлено в нашей лаборатории, хРТПХ, индуцированная переносом лимфоидных клеток от мышей линии DBA мышам-гибридам первого поколения (C57Bl/6xDBA/2)F1, развивается у части подопытных животных по Th1-зависимому варианту, приводящему к возникновению выраженного иммунодефицитного состояния, в то время как у другой части участвующих в эксперименте мышей проявляется Th2-зависимый вариант этого иммунопатологического процесса с формированием в конечном итоге иммунокомплексного гломерулонефрита [6, 7]. Поскольку итог развития хРТПХ в данной модели у индивидуальных подопытных мышей легко установить по наличию (или отсутствию) у них симптомов нефрита, она представляет собой надежную тест-систему, позволяющую изучать влияние разнообразных факторов на Th1/ Th2-соотношение в организме и разделять экспериментальных животных на группы с преобладанием активности Т-хелперов первого и второго типа. В данной работе она была использована для определения концентрации вкДНК в крови мышей при развитии у них вышеуказанных оппозитных вариантов хРТПХ.

Материалы и методы

В работе использовали самок мышей-гибридов (C57Bl/6xDBA/2)F1 и самок мышей линий DBA/2, возрастом 6-8 недель, полученных из SPF-вивария ИЦиГ СО РАН (г. Новосибирск). Исследование одобрено этическим комитетом НИИФКИ (протокол № 92 от 10.11.2015).

Для индукции хронической РТПХ мышам-гибридам (C57Bl/6xDBA/2)F1 вводили клетки селезенки линии DBA/2 по 60-70 × 10⁶ клеток в 0,5 мл среды путем внутривенной инъекции в хвостовую вену дважды с интервалом в 6 дней. В качестве контролей использованы интактные мыши-гибриды того же пола и возраста и мыши-гибриды с сингенным переносом [C57Bl/6xDBA/2)F1 → C57Bl/6xDBA/2)F1]. Внеклеточная ДНК измерялась в динамике развития хРТПХ. Выделение и количественное определение ДНК из плазмы крови и фракции, связанной с мембранами клеток крови, производилось с помощью набора diaGene (ООО «Диаэм», Россия), в соответствии с протоколом производителя. Определение вкДНК проводили с помощью флюоресцентного красителя Quant-iT^TM PicoGreen (Invitrogen, США). Статистическую обработку результатов проводили методами непараметрической статистики с использованием критерия Манна–Уитни с использованием программного обеспечения STATISTICA 7.0 (StatSoft, США).

Результаты и обсуждение

Данные, полученные при измерении вкДНК в динамике развития хРТПХ на ее ранних этапах, определяющих разделение экспериментальных животных на две оппозитные группы, в зависимости от преобладания у них активности Th1- и Th2-лимфоцитов, представлены в таблице 1.

 

Таблица 1. Концентрация внеклеточной ДНК в плазме крови и фракции, связанной с мембранами клеток крови, в зависимости от срока после индукции хронической реакции «трансплантат против хозяина», М±m

Table 1. The concentration of extracellular DNA in blood plasma and fraction of membrane-bound blood cells depending on the period after induction of chronic graft-versus-host disease, М±m

Экспериментальные группы Experimental groups	Срок после начала эксперимента Time after the start of the experiment
	5 дней 5 days	13 дней 13 days	27 дней 27 days
Интактные мыши Intact mice	25±1 / 31±6	52±8 / 36±4	32±4 / 25±2
Сингенный перенос Syngeneic transfer	36±5 / 29±5	34±3 / 25±1	36±2 / 32±1
Хроническая РТПХ Chronic GVHD	50±8* / 29±3	54±10 / 25±1	49±9 / 26±3

Примечание. Уровни внеклеточной ДНК в крови животных представлены в виде: вкДНК в плазме крови (нг/мл) / вкДНК, связанная с мембранами клеток (нг/мл); n = 5; * – достоверное отличие от интактного контроля (p < 0,05).

Note. The levels of extracellular DNA in the blood of animals are presented as: cfDNA in blood plasma (ng/mL) / cfDNA bound to cell membranes (ng/mL); n = 5; *, significant difference from intact control (p < 0.05).

 

Как видно из сравнения с интактным контролем и с группой мышей, которым были перенесены сингенные лимфоциты, в начальном периоде индукции хРТПХ развитие иммунопатологического процесса сопровождается некоторым увеличением уровней вкДНК в крови. При этом речь идет лишь о средней концентрации вкДНК в плазме, в то время как величина той фракции вкДНК, которая прочно связана с мембранами клеток, заметно не изменяется. Однако уже к концу первого месяца после переноса донорских клеток, вызывающих развитие хРТПХ, измеряемые уровни вкДНК в крови значимо не отличаются от их величин в контрольных группах.

Такое поведение исследуемых параметров легко объяснить тем, что, как установлено для использованной нами полуаллогенной системы [8], в первую неделю после переноса донорских клеток Th1- и Th2-зависимые иммунные реакции развиваются параллельно и приводят к выраженному росту уровней цитокинов, продуцируемых как Th1-, так и Th2-лимфоцитами. В дальнейшем происходит разделение животных на два оппозитных варианта развития хРТПХ, но внешние признаки такого расхождения внутри группы подопытных животных появляются лишь через три месяца после индукции хРТПХ. Результаты исследования уровней вкДНК в крови после формирования различимых вариантов хРТПХ даны на рисунке 1.

Показано, что разделение мышей с хРТПХ на Th1-зависимый (lupus^-) и Th2-зависимый (lupus⁺) варианты существенно влияет на поведение интересующего нас параметра. В группе мышей с иммунодефицитом, который является исходом развития хРТПХ по Th1-зависимому варианту, уровни вкДНК практически не отличаются от соответствующих значений в контрольной группе животных с сингенным переносом (рис. 1). В то же время у тех мышей, у которых развитие иммунопатологического процесса пошло по Th2-зависимому пути с поликлональной активацией В-лимфоцитов, продуцирующих большое количество аутоантител, и через три месяца привело к формированию иммунокомплексного нефрита, обнаруживается значимое повышение уровня вкДНК в крови.

 

Рисунок 1. Концентрация внеклеточной ДНК в крови мышей через три месяца после индукции хронической РТПХ в сравнении с сингенным контролем

Примечание. По оси ординат: концентрация вкДНК, нг/мл; по оси абцисс: 1-я группа – сингенный перенос (n = 9), 2-я группа – lupus^- (n = 8), 3-я группа – lupus⁺ (n = 7). Светлый столбец – плазма, темный столбец – фракция, связанная с мембранами клеток крови. * – достоверное отличие от групп мышей с сингенным переносом (p < 0,01).

Figure 1. Concentration of extracellular DNA in the blood of mice three months after induction of chronic GVHD in comparison with syngeneic control

Note. Ordinate axis: concentration of cfDNA, ng/mL; abscissa axis: 1^st group, syngeneic transfer (n = 9); 2^nd group, lupus^- (n = 8); 3^rd group, lupus⁺ (n = 7). Light column, plasma; dark column, fraction bound to blood cell membranes. *, statistically significant differences from groups of mice with syngeneic transfer p < 0.01.

 

Интересно, что подобная связь уровня вкДНК в крови с воспалительным процессом в почках была обнаружена у больных системной красной волчанкой (СКВ), то есть при заболевании, экспериментальной моделью которого считается развитие хРТПХ в использованной нами полуаллогенной системе. Было показано [9], что уровень вкДНК в плазме крови существенно повышен лишь в группе тех пациентов с СКВ, у которых развитие болезни привело к возникновению волчаночного иммунокомплексного нефрита, при этом он повышается в фазы обострения заболевания и снижается в фазы ремиссии, параллельно уменьшению активности воспалительного процесса.

Полученные нами данные свидетельствуют в пользу того, что само по себе доминирование активности Th1-лимфоцитов и сдвиг баланса хелперной активности в эту сторону, характерные для группы мышей с развившимся иммунодефицитом (lupus^-), не ведут к повышению уровней вкДНК в крови. А такое повышение мы видим при развитии активного воспалительного процесса в группе мышей с нефритом (lupus⁺). При этом предшествовавшее преобладание в этой группе активности Th2-лимфоцитов, приведшее в конечном итоге к развитию воспаления в почках, не предотвращает того увеличения уровня вкДНК, которым сопровождается возникновение нефрита.

Заключение

Таким образом, результаты проведенных экспериментов склоняют к выводу о том, что наблюдаемые при иммунопатологических процессах изменения уровней вкДНК в крови не связаны непосредственно с состоянием баланса хелперов в организме и что Th1-лимфоциты способны, по-видимому, воздействовать на метаболизм вкДНК лишь благодаря своему влиянию на развитие воспалительных реакций. В то же время следует отметить, что окончательное разрешение вопроса о влиянии Th1/Th2-баланса на концентрацию вкДНК в крови требует расшифровки конкретных патофизиологических механизмов, определяющих величину этого показателя.

Об авторах

Елена Давидовна Гаврилова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии»

Автор, ответственный за переписку.
Email: edav.gavr@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2014-3397

к.б.н., заведующая лабораторией экспериментальной иммунотерапии

Россия, 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

Елена Владимировна Гойман

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии»

Email: l.goiman@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6443-6917

к.м.н., научный сотрудник лаборатории экспериментальной иммунотерапии

Россия, 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

Елена Николаевна Демченко

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии»

Email: elena.demchenko@gmail.com
ORCID iD: 0009-0001-5178-5616

к.х.н., научный сотрудник лаборатории экспериментальной иммунотерапии

Россия, 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

Николай Николаевич Вольский

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии»

Email: dtheory@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9341-1997

к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной иммунотерапии

Россия, 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

Список литературы

Дополнительные файлы