Влияние обогащенной среды на пространственную память и экспрессию маркеров активации микроглии у мышей линии Balb/c

Полный текст

Введение

Обогащение среды обитания лабораторных животных благоприятно сказывается на процессах нейрональной пластичности, в том числе способствует повышению уровня нейрогенеза в гиппокампе и более эффективному пространственному ориентированию. Известно, что обогащенная среда (ОС) также оказывает иммуномодулирующий эффект: периферические макрофаги, выделенные из мышей, проживавших в ОС, демонстрируют более высокую фагоцитарную активность ex vivo по сравнению с макрофагами мышей, которых содержали в стандартных условиях вивария [5]; в гиппокампе крыс из ОС значительно увеличивается уровень экспрессии IL-10 и его рецептора IL-10Ra по сравнению с животными, которых содержали в стандартных условиях [13]. Так как иммунные клетки и выделяемые ими молекулы модулируют процессы нейрональной пластичности, актуальным является исследование влияния ОС на уровень нейрогенеза у грызунов с разным иммунным статусом. Большинство исследований влияния ОС на процессы нейрональной пластичности проводят на крысах или мышах линии C57Bl/6. По сравнению с C57Bl/6, мыши линии Balb/c характеризуются преобладанием гуморального (Th2), а не клеточного (Th1) типов иммунного ответа, что связано с различиями в участке H2 главного локуса гена гистосовместимости MHCI (H2d у Balb/c и H2b у C57Bl/6), а также более высоким уровнем тревожности, выявляемом при поведенческом фенотипировании.

Целью нашего исследования было оценить влияние ОС на пространственную память, уровень нейрогенеза, а также признаки активации резидентных макрофагов (микроглии) в гиппокампе мышей линии Balb/c.

Материалы и методы

Исследование проводили на 4-месячных самках мышей линии Balb/c. В возрасте 2 месяцев животных разделили на две группы по условиям проживания: мышей из контрольной группы содержали в стандартных клетках (28 × 40 × 18 см, по 2 мыши на клетку), а мышей из экспериментальной группы помещали в условия обогащенной среды (49 × 34 × 52 см, 5 мышей на клетку) с беговым колесом и игрушками, которые меняли каждые 3 дня. Животных содержали в виварии с циклом освещенности 12/12, при 23±2 °C с едой и водой ad libitum. Все манипуляции с животными были одобрены Независимым этическим комитетом Центра клинических исследований БФУ им. И. Канта, Калининград, протокол 27/2021.

Для оценки пространственной памяти и обучаемости животных использовали лабиринт К. Барнс. Установка представляет собой круглую платформу диаметром 90 см, по краям которой циркулярно расположены 20 сквозных отверстий диаметром 5 см каждое. Во время фазы привыкания и фазы тренировок одно из отверстий ведет в безопасное убежище для животных. Для ориентирования при поиске убежища по краям лабиринта располагаются четыре черно-белые визуальные подсказки. Тест включает в себя три этапа: фазу привыкания, фазу тренировок и пробную фазу. В фазу привыкания животное помещают в убежище и на платформу лабиринта для знакомства с установкой и избежания возникновения в дальнейшем неофобных реакций при проведении поведенческого фенотипирования. Фаза тренировок включает в себя 3 ежедневных тренировки на протяжении 5 дней. Во время этой фазы фиксировали время, за которое каждое животное находило убежище. Если время поиска убежища превышало 3 минуты, мышь направляли к отверстию с ним. Перерыв между тренировками у каждого животного составляет 30 минут. Во время пробной фазы убежище убирают и фиксируют время, проведенное в целевом секторе (по две лунки справа и слева от отверстия,в котором раньше находилось убежище). Первая пробная сессия проводилась через 24 часа после последней тренировки, вторая сессия – через 96 часов. Записи движения животных проводили с помощью цифровой видеокамеры (GoPro Hero 9 Black) и далее анализировали с использованием программного обеспечения BehaviorCloud (Калифорния, США).

На следующий день после проведения всех поведенческих тестов проводили транскардиальную перфузию. Животных подвергали глубокой анестезии изофлураном (Aesica Queenborough, Квинборо, Великобритания), помещали на лоток и выполняли разрез грудной клетки и диафрагмы, затем подводили перфузионную иглу к левому желудочку, а правое предсердие надрезали для оттока крови. Через перфузионную иглу, подключенную к насосу, подавали 0,9%-ный раствор NaCl комнатной температуры в течение нескольких минут. После перфузии проводили декапитацию и извлечение гиппокампа. Далее образцы гиппокампа помещали в раствор Extract RNA (ЗАО «Евроген», Россия) для выделения суммарной РНК с помощью протокола от производителя. Концентрацию РНК измеряли флуориметром Qubit 2.0 (Invitrogen, США). Суммарную РНК в количестве 1 мкг использовали для получения кДНК с помощью набора MMLV RT kit (ЗАО «Евроген», Россия). ПЦР проводили с использованием генспецифичных праймеров для BDNF, CD68, DCX, FGF2, IBA1, IL-1B, IL-10, SOX2, TMEM119, TNFα, в качестве референсного гена брали GAPDH. Анализ данных проводили с использованием метода ∆∆Ct. Последовательности праймеров использовали следующие: BDNF (acccatgggattacacttgg; agctgagcgtgtgtgacagt), CD68 (ggcggtggaatacaatgtgtcc; agcaggtcaaggtgaacagctg); DCX (cagcatctccacccaacc; aagtccattcatccgtgacc); FGF2 (ccaagcagaagagagaggagttg; cagccgtccatcttccttcatag); GAPDH (catcactgccacccagaagactg; atgccagtgagcttcccgttcag); IBA1 (aagggaatgagtggaaag; cagacgctggttgtcttagg); IL-1β (aaagctctccacctcaatgg; tgtcgttgcttggttctcc); IL-10 (gccctttgctatggtgtcc; tctccctggtttctcttccc); SOX2 (tgcagtacaactccatgacc; cggacttgaccacagagc); TMEM119 (actacccatcctcgttccctga; tagcagccagaatgtcagcctg); TNFα (tcagtgtcttcaccaaaggg; gcagtggaccatctaactcg).

Статистическую обработку данных проводили с использованием программного обеспечения PRISM GraphPad™ (GraphPad Software, США). Нормальность выборки проверяли с помощью теста Шапиро–Уилка. Так как данные не принадлежат нормальному распределению, использовали непараметрический тест Манна–Уитни. Различия между исследуемыми группами считались статистически значимыми при уровне p ≤ 0,05. Результаты представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

Результаты и обсуждение

По результатам поведенческого фенотипирования мышей в лабиринте К. Барнс животные из ОС затрачивали меньше времени на поиск убежища с самого начала тренировок (рис. 1А), что указывает на более эффективную обработку новой информации и ускоренное формирование пространственной памяти. К концу тренировок обе группы животных сравнялись в результатах. Пробная фаза 1 лабиринта Барнс служит для оценки кратковременной памяти, пробная фаза 2 – долговременной. Статистически значимых различий при сравнении времени, проведенного в целевом секторе в конце тренировок, обнаружено не было ни в одну из пробных фаз. Интересно, что мыши Balb/с отличаются высоким уровнем тревожности, однако это не мешает животным успешно ориентироваться в лабиринте Барнс и запоминать местоположение убежища.

 

Рисунок 1. Влияние обогащенной среды на пространственную память (А-В), уровень нейрогенеза (Г, Д), экспрессию трофических факторов (Е, Ж), интерлейкинов и маркеров активации микроглии (З-Н) в гиппокампе мышей линии Balb/c

Figure 1. Effect of an enriched environment on spatial memory (A-С), the level of neurogenesis (D, E), expression of trophic factors (F, G), interleukins and microglial activation markers (H-M) in the hippocampus of Balb/c mice

 

Пространственное ориентирование в значительной степени зависит от работы гиппокампа, в том числе от эффективного разделения паттернов нейрональной активности. Образование новых нейронов в зубчатой извилине способствует разделению паттернов [6]. По результатам ПЦР в реальном времени у мышей, содержавшихся в условиях ОС, статистически значимо увеличился уровень экспрессии маркера стволовых клеток SOX2 и маркера незрелых нейронов DCX в гиппокампе (рис. 1Г, Д), что свидетельствует об активации процессов нейрогенеза и дифференциации нейронов. При этом уровень экспрессии нейротрофического фактора мозга BDNF не изменился, а экспрессия фактора роста фибробластов-2 (FGF2) значимо увеличилась по сравнению с контрольной группой (рис. 1Е, Ж). FGF2 способствует пролиферации и дифференциации нейрональных предшественников в гиппокампе, и в случае ишемического повреждения вследствие окклюзии церебральной артерии FGF2 является необходимым и достаточным фактором для активации процессов нейрогенеза [14]. Источником FGF2 в мозге предположительно являются астроциты, а резидентные макрофаги (микроглия) экспрессирует рецепторы к полипептидам семейства FGF – FGFR1, FGFR2, FGFR3. Сигнализация FGF2-FGFR1 регулирует активацию микроглии и развитие воспаления, взаимодействуя с поверхностным нейрональным гликопротеином CD200, рецептор к которому в головном мозге экспрессируют только микроглиальные клетки. Сигнализация CD200 – CD200R способствует поддержанию нейропротекторного фенотипа микроглии (М2) и ингибирует развитие воспалительных реакций [10, 11]. FGFR1 также взаимодействует с серотониновыми рецепторами 5HT1A/B, образуя гетерокомплексы [4], которые представляют большой интерес в качестве молекулярных мишеней для лечения депрессивных расстройств. Микроглиальные клетки экспрессируют рецепторы к серотонину [9], в частности сигнализация через 5HT2B предположительно способствует М2-поляризации микроглии [9, 12]. Таким образом, увеличение экспрессии FGF2 в гиппокампе мышей, содержавшихся в условиях ОС, стимулирует нейрогенез и поддерживает нейропротекторный фенотип резидентных макрофагов мозга.

Уровень экспрессии провоспалительного цитокина IL-1β и противовоспалительного IL-10 в гиппокампе после содержания мышей в ОС значительно не изменились, в то время как экспрессия TNFα существенно выросла (рис. 1З-Н). При анализе экспрессии цитокинов мы рассматриваем в качестве их источников только клетки мозга (преимущественно микроглию), так как всем животным перед забором материала была проведена транскардиальная перфузия стерильным физиологическим раствором. TNFα – провоспалительный цитокин, выделяемый макрофагами М1 в период развития воспалительной реакции, например, в ответ на стимуляцию бактериальным липополисахаридом или IFNγ [1, 2, 3]. Несмотря на известный нейротоксический эффект TNFα, конкретная роль цитокина зависит от его концентрации, стадии дифференциации клетки, а также от сигнализации через TNFR1/TNFR2-рецепторы, так как активация TNFR2 предположительно может оказывать нейропротекторный эффект [7]. Так как в условиях увеличения экспрессии TNF в гиппокампе мы также наблюдаем активацию процессов нейрогенеза и дифференциации нейронов, можно предположить, что цитокин не оказывает цитотоксического эффекта на нервные стволовые клетки в условиях ОС. Уровень экспрессии микроглиальных маркеров Iba1 и TMEM119 значительно увеличился у мышей в ОС по сравнению с животными, содержавшимися в стандартных условиях. В мозге TMEM119 локализован исключительно в микроглие, и снижение его экспрессии наблюдается в реактивных, поляризованных М1 микроглиальных клетках [8]. Несмотря на увеличение экспрессии Iba1, что характерно для М1 фенотипа, уровень экспрессии одного из маркеров активации – CD68 существенно не изменился у мышей в ОС, это позволяет предположить, что микроглиальные клетки поляризованы по типу М0/М2, несмотря на увеличение экспрессии Iba1 и TNFα.

Заключение

Полученные данные позволяют предположить, что содержание мышей линии Balb/c в условиях ОС способствует повышению уровня нейрогенеза в зубчатой извилине гиппокампа и более эффективному пространственному ориентированию. Анализ экспрессии нейротрофических факторов, а также цитокинов и маркеров активации резидентных макрофагов мозга (микроглии) показал увеличение экспрессии FGF2, TNFα, Iba1 и TMEM119, в то время как уровни экспрессии BDNF, IL-1β, IL-10 и CD68 не изменились. Таким образом, у мышей линии Balb/c в условиях ОС не наблюдается повышения экспрессии BDNF и IL- 10, что характерно для мышей C57Bl/6, однако это не препятствует пролиферации и дифференциации нейронов в зубчатой извилине, а также успешному пространственному ориентированию в лабиринте К. Барнс. Микроглиальные клетки у мышей линии Balb/c в условиях ОС, вероятно, поляризованы по типу М0/М2.

Об авторах

Таисия Павловна Лебедева

ФГАОУ ВО «Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта»

Email: lptaisiya@kantiana.ru
ORCID iD: 0009-0001-8983-3898

магистрант Высшей школы живых систем

Россия, г. Калининград

Екатерина Александровна Курилова

ФГАОУ ВО «Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта»

Email: ekaterinakuuurilova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0031-116X

аспирант Высшей школы живых систем

Россия, г. Калининград

Мария Валерьевна Сидорова

ФГАОУ ВО «Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта»

Email: masidorova1@kantiana.ru
ORCID iD: 0000-0003-3347-2920

старший преподаватель Высшей школы живых систем

Россия, г. Калининград

Оксана Павловна Тучина

ФГАОУ ВО «Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта»

Автор, ответственный за переписку.
Email: otuchina@kantiana.ru
ORCID iD: 0000-0003-1480-1311

к.б.н., доцент Высшей школы живых систем

Россия, 236006, г. Калининград, ул. Университетская, 2

Список литературы

Дополнительные файлы