Высокочувствительный мультиплексный анализ интерлейкинов в конденсате выдыхаемого воздуха у детей с бронхиальной астмой: диагностическая значимость IL-13 и IL-17А

Полный текст

Введение

Конденсат выдыхаемого воздуха (КВВ) – это жидкость, собранная из паров выдыхаемого воздуха, содержит широкий спектр разнообразных растворимых молекул, представляющих собой сложную смесь, которая состоит в основном из водяного пара, а также органических соединений, медиаторов воспаления и других биомолекул, отражающих состояние дыхательной системы. КВВ привлек значительное внимание в медицинских исследованиях как неинвазивный инструмент диагностики респираторных заболеваний, предоставляющий важные данные о воспалении дыхательных путей, окислительном стрессе и общем состоянии дыхательных путей [10, 13].

Метод был впервые предложен в 1980 году, но впоследствии приоритет Российской фундаментальной медицины в исследовании КВВ был утерян [1]. Существенную роль для продвижения методики анализа КВВ в научные исследования и клиническую практику сыграли опубликованные в 2005 году рекомендации Европейской респираторной ассоциации по стандартизации подходов к сбору и аналитике КВВ [4]. Широкое внедрение метода может существенно повлиять на лечение респираторных заболеваний и результаты лечения пациентов, что делает анализ КВВ одним из основных направлений в поиске инновационных неинвазивных диагностических стратегий.

Преимущества методики оценки КВВ заключаются в том, что сбор конденсата абсолютно неинвазивен, требует только спокойного дыхания в охлаждаемый конденсатор, не требует седации. Конденсат в основном продуцируется в мелких дыхательных путях и альвеолах, фактически обеспечивая биохимический снимок нижних дыхательных путей, кроме этого методика КВВ позволяет повторять оценку режиме реального времени, что полезно для диагностики, мониторинга прогрессирования заболевания, определения фенотипа и реакции на лечение. И, поскольку сбор КВВ включает в себя обычное дыхание без принудительных маневров, он легче переносится пациентами с дыхательной недостаточностью и может быть использован у детей, включая грудной возраст.

Однако исследования КВВ не лишены недостатков. Такие проблемы, как вариабельность методов сбора, потенциальное загрязнение слюной и отсутствие стандартизированных протоколов анализа, вызывают опасения относительно надежности КВВ как диагностического инструмента. Для преодоления этих возможных недостатков необходимо строго придерживаться соответствующих рекомендаций Европейского респираторного общества [4].

На сегодняшний день выполнено множество исследований, посвященных анализу разнообразных маркеров в КВВ при различных заболеваниях бронхолегочной системы у детей и взрослых [3, 5, 6, 8, 9, 14].

Функционирование интерлейкинов, в частности, IL-4, IL-5, IL-13 и IL-17, крайне важно в формировании различных эндотипов бронхиальной астмы (БА) у детей и определяет особенности клинического течения заболевания, а также эффективность терапии. Основными медиаторами Th2-опосредованного воспаления при БА являются IL-4 и IL-13: они запускают синтез IgE, вызывают гиперплазию бокаловидных клеток и усиливают секрецию слизи. IL-5 отвечает за созревание, активацию эозинофилов в дыхательных путях – это характерно для классического аллергического фенотипа астмы [7]. Продуцируемый Th17-клетками IL-17 участвует в развитии нейтрофильного воспаления и ремоделировании дыхательных путей, что часто ассоциируется с более тяжелым течением заболевания и резистентностью к стероидной терапии [11]. Анализ профиля этих цитокинов позволяет идентифицировать конкретный эндотип астмы у ребенка, а также прогнозировать течение заболевания и оптимизировать выбор таргетной терапии, что крайне важно при тяжелых формах БА. К настоящему времени данные о возможности детекции и диагностической значимости содержания цитокинов в КВВ у детей ограничены.

В связи с вышеперечисленным целью настоящего исследования было установить возможность детекции и диагностической значимости IL-4, IL-5, IL-13 и IL-17 в КВВ у детей с БА высокочувствительным методом мультиплексного анализа с попыткой преодоления проблемы высокого разведения биомаркеров КВВ путем предварительного концентрирования образцов.

Материалы и методы

В исследование было включено 169 детей в возрасте от 6 до 17 лет: 104 ребенка с верифицированным диагнозом «БА» и 65 практически здоровых детей без анамнеза атопии или хронических бронхолегочных заболеваний, сформировавших контрольную группу. Диагностика и оценка тяжести астмы проводились согласно рекомендациям Global Initiative for Asthma (2021) [2]. Протокол исследования получил одобрение Этического комитета Федерального исследовательского центра – Красноярского научного центра СО РАН. КВВ собирали с помощью устройства RTube Exhaler Breath Condensate Collector (Respiratory Research, США) и хранили при -80 °С до анализа.

Образцы КВВ проанализированы на наличие контаминации слюной с помощью иммуноферментного анализа концентрации альфа-амилазы (2 образца, которые дали положительны результат, исключили из исследования). Перед анализом проводили концентрирование образцов в 40-50 раз с помощью вакуумного концентратора с охлаждением (CentriVap, Labconco, США).

Измерение уровней IL-4, IL-5, IL-13 и IL- 17А проводили методом мультиплексного иммуноанализа на магнитных частицах (анализатор MAGPIX, Luminex, США; тест-система MILLIPLEX® Human High Sensitivity T Cell Magnetic Bead Panel, HSTCMAG-28SK, Германия), а преобразование сигналов в абсолютные концентрации выполняли в Milliplex Analyst (Luminex Corp, США) по протоколу производителя.

Статистическую обработку данных выполняли в IBM SPSS Statistics for Windows v. 26.0 (IBM Corp., США); количественные показатели представлены медианой и интерквартильным размахом – Me (Q0,25-Q0,75), а для сравнения групп использовали критерий χ2 Пирсона, двусторонний точный тест Фишера и U-критерий Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение

В таблице 1 представлены данные концентрации и частоты детекции IL-4, IL-5, IL-13, IL-17А в КВВ у детей с БА и в контрольной группе. В таблице 2 показаны частоты детекции интерлейкинов у детей с различной степенью тяжести БА.

Показано, что у детей с БА наблюдаются статистически значимые изменения концентраций интерлейкинов в КВВ по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Концентрации IL-4 и IL-5 были низкими и не показали статистически значимых различий между группами (p = 0,149 и p = 0,670 соответственно). Однако для IL-13 медиана концентрации составила 0,01 пг/мл у детей с БА по сравнению с 0,00 пг/мл в контрольной группе (p = 0,015), а частота детекции увеличилась с 30,8% до 53,9% (p = 0,003). Для IL-17А медиана концентрации составила 0,04 пг/мл у детей с БА, что также значительно выше, чем в контрольной группе (0,00 пг/мл, p = 0,001), а частота детекции возросла с 27,7% до 57,7% (p = 0,001).

 

Таблица 1. Концентрации и частоты детекции выше нижнего предела количественного определения изученных интерлейкинов в конденсате выдыхаемого воздуха в группе контроля и у детей с БА (пг/мл; n, %)

Table 1. Concentrations and detection frequencies above the lower limit of quantitative determination of the studied interleukins in exhaled air condensate in the control group and in children with asthma (pg/ml; n, %)

Интерлейкины Interleukins	Контроль Control n = 65	Астма Asthma n = 104	p
IL-4, концентрация, пг/мл IL-4, concentration, pg/mL	0,00 (0,00-0,38) [0, 00-3, 62]	0,38 (0,00-0,38) [0, 00-3, 62]	0,149
IL-4, частота детекции > 1,12 пг/мл IL-4, detection rate > 1.12 pg/mL	28 (43,1%)	57 (54,8%)	0,138
IL-5, концентрация, пг/мл IL-5, concentration, pg/mL	0,00 (0,00-0,01) [0, 00-0, 06]	0,00 (0,00-0,01) [0, 00-0, 04]	0,670
IL-5, частота детекции > 0,12 пг/мл IL-5, detection rate > 0.12 pg/mL	17 (26,2%)	31 (29,8%)	0,608
IL-13, концентрация, пг/мл IL-13, concentration, pg/mL	0,00 (0,00-0,01) [0, 00-1, 83]	0,01 (0,00-0,01) [0, 00-0, 13]	0,015
IL-13, частота детекции > 0,23 пг/мл IL-13, detection rate > 0.23 pg/mL	20 (30,8%)	56 (53,9%)	0,003
IL-17А, концентрация, пг/мл IL-17А, concentration, pg/mL	0,00 (0,00-0,04) [0, 00-0, 21]	0,04 (0,00-0,04) [0, 00-0, 28]	0,001
IL-17А, частота детекции > 0,33 пг/мл IL-17А, detection rate > 0.33 pg/mL	18 (27,7%)	60 (57,7%)	0,001

Примечание. p – значения по U-тесту Манна–Уитни и тесту Пирсона χ2. Данные представлены в виде медианы (интерквартильного размаха) [Min-Max].

Note. p, values according to the Mann–Whitney U-test and the Pearson test χ2. The data is presented as the median (interquartile range) [Min-Max].

 

Измерение частоты детекции интерлейкинов в зависимости от степени тяжести БА показало, что с увеличением тяжести заболевания частота детекции IL-13 и IL-17А возрастает (табл. 2). Для IL-4 и IL-5 не было выявлено статистически значимых различий между группами с различной степенью тяжести БА и контрольной группой. В то же время частота детекции IL-13 (> 0,23 пг/ мл) увеличилась с 30,8% в контрольной группе до 72,7% у детей с тяжелой БА (p = 0,015). Для IL- 17А частота детекции (> 0,33 пг/мл) составила 27,7% в контрольной группе и 63,6% у детей с тяжелой БА (p = 0,034).

 

Таблица 2. Частоты детекции изученных интерлейкинов выше нижнего предела количественного определения в конденсате выдыхаемого воздуха у детей с различной степенью тяжести БА (n, %)

Table 2. Detection frequencies of the studied interleukins above the lower limit of quantitative determination in exhaled air condensate in children with varying degrees of asthma severity (n, %)

Интерлейкины Interleukins	Контроль Control (n = 65)	Легкая БА Mild bronchial asthma (n = 58)	Среднетяжелая БА Moderate bronchial asthma (n = 35)	Тяжелая БА Severe bronchial asthma (n = 11)	p
	0	1	2	3
IL-4 (> 1,12 пг/мл) IL-4 (> 1.12 pg/mL)	28 (43,1%)	35 (60,3%)	16 (45,7%)	6 (54,6%)
IL-5 (> 0,12 пг/мл) IL-5 (> 0.12 pg/mL)	17 (26,2%)	20 (34,5%)	9 (25,7%)	2 (18,2%)
IL-13 (> 0,23 пг/мл) IL-13 (> 0.23 pg/mL)	20 (30,8%)	32 (55,2%)	16 (45,7%)	8 (72,7%)	p0-1 = 0,010 p0-3 = 0,015
IL-17А (> 0,33 пг/мл) IL-17A (> 0.33 pg/mL)	18 (27,7%)	30 (51,7%)	23 (65,7%)	7 (63,6%)	p0-1 = 0,009 p0-2 < 0,001 p0-3 = 0,034

Примечание. Использован двусторонний точный тест Фишера; представлены только значения p < 0,05.

Note. A two-sided accurate Fischer test was used; only values of p < 0.05 are presented.

 

Полученные результаты показывают возможность детекции цитокинов в КВВ у детей с БА с использованием высокочувствительного мультиплексного анализа, однако требуется предварительное концентрирование образцов. Полученные нами данные о крайне низких концентрациях цитокинов в КВВ, не превышающих 1 пг/мл, согласуются с ранее опубликованными результатами Stiegel M.A. et al., что подтверждает методологическую корректность проведенного исследования [12].

Отдельный интерес представляет показанное нами статистически значимое повышение частоты детекции IL-13 и IL-17А у детей с БА по сравнению с контрольной группой, а также прогрессивное увеличение частоты их выявления с нарастанием тяжести заболевания. Эти обнаружения соответствуют современным представлениям о патогенезе астмы, где IL-13 играет ключевую роль в развитии аллергического воспаления и гиперреактивности дыхательных путей, а IL-17А ассоциирован с более тяжелым течением заболевания и стероидной резистентностью [11]. Отсутствие значимых различий в концентрациях IL-4 и IL-5 между группами может указывать на особенности локальной продукции этих цитокинов, их быстрой деградации в дыхательных путях или техническими ограничениями метода детекции даже после концентрирования образцов.

Заключение

Представленные результаты позволяют рассматривать IL-13 и IL-17А в КВВ как потенциальные неинвазивные биомаркеры тяжести БА у детей, что прежде всего важно для мониторинга течения заболевания и оптимизации терапии. Тем не менее для внедрения метода в клиническую практику требуются дополнительные исследования на значительно более крупной когорте пациентов, стандартизация процедуры концентрирования образцов и определение четких пороговых значений для различных фенотипов астмы. Ограничением исследования является относительно небольшое количество пациентов с тяжелой астмой, что требует осторожности при интерпретации результатов для этой подгруппы. Тем не менее полученные данные демонстрируют перспективность использования КВВ для неинвазивной оценки локального воспаления дыхательных путей у детей с БА.

Об авторах

М. В. Смольникова

Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера – обособленное подразделение ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр “Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук”»

Автор, ответственный за переписку.
Email: smarinv@yandex.ru

к.б.н., руководитель группы молекулярно-генетических исследований, ведущий научный сотрудник

Россия, Красноярск

Н. Н. Горбачева

Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера – обособленное подразделение ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр “Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук”»

Email: smarinv@yandex.ru

старший научный сотрудник клинического отделения соматического и психического здоровья детей

Россия, Красноярск

С. Ю. Терещенко

Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера – обособленное подразделение ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр “Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук”»

Email: smarinv@yandex.ru

д.м.н., профессор, заведующий клиническим отделением соматического и психического здоровья детей

Россия, Красноярск

Список литературы

Дополнительные файлы