ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОДЕФИЦИТНОЙ ЛИНИИ НОКАУТНЫХ МЫШЕЙ ПО ГЕНУ IFNAR1 И ПРОБЛЕМЫ ПРОТОКОЛА ТРАНСГЕНЕЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЫШЕЙ ЛИНИИ C57BL/6



Цитировать

Полный текст

Аннотация

Лабораторная мышь является наиболее изученной и детально охарактеризованной моделью для биомедицинских исследований и является популярным объектом в вирусологии. Однако, вследствие межвидовых различий между мышью и человеком зачастую невозможно проведение экспериментов из-за невосприимчивости мышей ко многим вирусам человека. Один из путей решения этой проблемы – это получение нокаутных мышей с ослабленным иммунитетом. Такие мыши являются универсальными моделями для вирусологических исследований из-за неспецифической повышенной восприимчивостью к различным патогенам человека. Использование таких мышей позволяет проводить с вирусами, для которых нет генетически-модифицированных линий мышей со специфической восприимчивостью. В настоящем исследовании представлены результаты работы по получению нокаутной линии мышей по гену Ifnar1 при помощи двух разных подходов с использованием системы геномного редактирования CRISPR. Первый – это одномоментное удаление экзона и интеграция фланкированного loxP-сайтами экзона. Второй – это двухэтапная интеграция loxP-сайтов для фланкирования экзона без его удаления. Оба подхода применяются для получения conditional (условного, программируемого) нокаута. Также, для обоих подходов является характерным удаления экзона и получение мышей с классическим (конститутивным) нокаутом. В классических схемах трансгенеза принято получать эмбрионы для микроинъекции от самок-гибридов первого поколения, так как это упрощает работу. Однако, после получения генетически модифицированных мышей требуется проведения времязатратных возвратных скрещиваний для получения конгенных линий. Тем не менее, современные технологии позволяют использовать инбредные линии мышей для получения эмбрионов и микроинъекции, что значительно сокращает время для получения генетически-модифицированных линий мышей. В нашей работе мы использовали инбредную линию мышей C57BL/6 (SPF-виварий ИЦиГ СО РАН, Новосибирск) для получения эмбрионов и микроинъекции. Однако, при проведении данных работ мы столкнулись с несколькими проблемами. Во-первых, мы отмечаем значительное снижение эффективности стандартного протокола суперовуляции. Во-вторых, мы столкнулись с проблемой плохой приживаемости инъецированных эмбрионов после эмбриотрансфера. Обе эти проблемы кардинальным образом снизили эффективность протоколов трансгенеза и затруднили получение целевых нокаутных линий мышей. Наиболее вероятным объяснением проблем, которые возникли в ходе нашей работы, может быть дрейф генов. А самым простым и эффективным способом решения данных проблем является покупка инбредных линий мышей является их покупка из зарубежных вивариев, в которых соблюдаются современные правила по контролю генетической стабильности.

Об авторах

Наталья Анатольевна Сметанникова

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)

Email: smetannikova@vector.nsc.ru
Scopus Author ID: 6504237445

Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории геномного редактирования (в составе отдела геномных исследований). 

Россия, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, р.п. Кольцово, 630559, Россия.

Гузель Ильдаровна Давлетшина

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)

Email: davletshina_gi@vector.nsc.ru
Scopus Author ID: 57222272758

научный сотрудник лаборатории геномного редактирования (в составе отдела геномных исследований).

Россия, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, р.п. Кольцово, 630559, Россия.

Алексей Николаевич Кораблев

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)

Автор, ответственный за переписку.
Email: korablevalexeyn@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0571-6935

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела геномных исследований

Россия

Список литературы

  1. Кораблев А. Н., Серова И. А., Скрябин Б. В. Манипуляции с ранними эмбрионами мыши для создания генетически модифицированных животных // Вавиловский журнал генетики и селекции. – 2017. – Т.21, № 7. – C. 758–763.
  2. Мензоров А. Г., Лукьянчикова В. А., Кораблев А. Н., Серова И. А., Фишман В. С. Практическое руководство по редактированию геномов системой CRISPR/Cas9 // Вавиловский журнал генетики и селекции. – 2017. – Т.20, № 6. – C. 930–944.
  3. Abe T., Inoue K., Kiyonari H. Efficient CRISPR/Cas9-Assisted knockin of large DNA donors by pronuclear microinjection during S-Phase in mouse zygotes. Methods in Molecular Biology., 2023, Vol. 2637, pp. 181–194.
  4. Abeynaike S., Paust S. Humanized mice for the evaluation of novel HIV-1 therapies. Frontiers in Immunology., 2021, Vol. 12, no. 636775.
  5. Barham W., Hsu M., Liu X., Harrington S.M., Hirdler J.B., Gicobi J.K., Zhu X., Zeng H., Pavelko K.D., Yan Y., Mansfield A.S., Dong H. A novel humanized PD-1/PD-L1 mouse model permits direct comparison of antitumor immunity generated by food and drug administration–approved PD-1 and PD-L1 inhibitors. Immunohorizons., 2023, Vol. 7, no. 1, pp. 125–139.
  6. Battulin N., Kovalzon V.M., Korablev A., Serova I., Kiryukhina O.O., Pechkova M.G., Bogotskoy K.A., Tarasova O.S., Panchin Y. Pannexin 1 transgenic mice: human diseases and sleep-wake function revision. International Journal of Molecular Sciences., 2021, Vol. 22, no. 10, p. 5269.
  7. Behringer R., Gertsenstein M., Nagy K.V., Nagy A. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2014, 814 p.
  8. Benavides F., Rülicke T., Prins J.B., Bussell J., Scavizzi F., Cinelli P., Herault Y., Wedekind D. Genetic quality assurance and genetic monitoring of laboratory mice and rats: FELASA Working Group Report. Laboratory Animals., 2020, Vol. 54, no. 2, pp. 135–148.
  9. Browning J., Horner J.W., Pettoello-Mantovani M., Raker C., Yurasov S., DePinho R.A., Goldstein H. Mice transgenic for human CD4 and CCR5 are susceptible to HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A., 1997, Vol. 94, no. 26, pp. 14637-14641.
  10. Bruter A.V., Korshunova D.S., Kubekina M.V., Sergiev P.V., Kalinina A.A., Ilchuk L.A., Silaeva Y.Y., Korshunov E.N., Soldatov V.O., Deykin A.V. Novel transgenic mice with Cre-dependent co-expression of GFP and human ACE2: a safe tool for study of COVID-19 pathogenesis. Transgenic research., 2021, Vol. 30, no. 3, pp. 289–301.
  11. Chang T.K., Ho P., Liang C.T., Yu C.K. Effects of vaginal septa on the reproductive performance of BALB/cByJNarl mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS., 2013, Vol. 52, no. 5, pp. 520–523.
  12. Chen Z. Monkey Models and HIV Vaccine Research. Advances in experimental medicine and biology., 2018, Vol. 1075, pp. 97–124.
  13. Doench J.G., Fusi N., Sullender M., Hegde M., Vaimberg E.W., Donovan K.F., Smith I., Tothova Z., Wilen C., Orchard R., Virgin H.W., Listgarten J., Root D.E. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature biotechnology., 2016, Vol. 34, no. 2, pp. 184–191.
  14. Doetschman T. Influence of genetic background on genetically engineered mouse phenotypes. Methods in molecular biology., 2009, Vol. 530, pp. 423–433.
  15. Dong W., Mead H., Tian L., Park J.G., Garcia J.I., Jaramillo S., Barr T., Kollath D.S., Coyne V.K., Stone N.E., Jones A., Zhang J., Li A., Wang L.S., Milanes-Yearsley M., Torrelles J.B., Martinez-Sobrido L., Keim P.S., Barker B.M., Caligiuri, M.A., Yu J. The K18-Human ACE2 transgenic mouse model recapitulates non-severe and severe COVID-19 in response to an infectious dose of the SARS-CoV-2 virus. Journal of -virology., 2022, Vol. 96, no. 1.
  16. Escaffre O, Juelich T.L., Neef N., Massey S., Smith J., Brasel T., Smith J.K., Kalveram B., Zhang L., Perez D., Ikegami T., Freiberg A.N., Comer J.E. STAT-1 knockout mice as a model for wild-type Sudan virus (SUDV). Viruses., 2021, Vol. 13, no. 7, p. 1388.
  17. Estes J. D., Wong S. W., Brenchley J. M. Nonhuman primate models of human viral infections. Nature Reviews Immunology., 2018, Vol. 18, no. 6, pp. 390–404.
  18. Fletcher P., Feldmann F., Takada A., Crossland N.A., Hume A.J., Albariño C., Kemenesi G., Feldmann H., Mühlberger E., Marzi A. Pathogenicity of Lloviu and Bombali viruses in type I interferon receptor knockout mice. The Journal of Infectious Diseases., 2023, Vol. 228, no. Supplement 7, pp. S548–S553.
  19. Flier J. S. The problem of irreproducible bioscience research. Perspectives in Biology and Medicine., 2022, Vol. 65, no 3, pp. 373–395.
  20. Fujii H., Fukushi S., Yoshikawa T., Nagata N., Taniguchi S., Shimojima M., Yamada S., Tani H., Uda A., Maeki T., Harada S., Kurosu T., Lim C.K., Nakayama E., Takayama-Ito M., Watanabe S., Ebihara H., Morikawa S., Saijo M. Pathological and virological findings of type I interferon receptor knockout mice upon experimental infection with Heartland virus. Virus Research., -2024, Vol. 340, pp. 199301.
  21. Gearhart S., Kalishman J., Melikyan H., Mason C., Kohn D.F. Increased incidence of vaginal septum in C57BL/6J mice since 1976. Comparative medicine., 2004, Vol. 54, no. 4, pp. 418–421.
  22. Gordon J.W., Scangos G.A., Plotkin D.J., Barbosa J.A., Ruddle F.H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences., 1980, Vol. 77, no. 12, pp. 7380–7384.
  23. Hogan B., Costantini F., Lacy E. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1986, 332 p.
  24. Horii T., Morita S., Kimura M., Terawaki N., Shibutani M., Hatada I. Efficient generation of conditional knockout mice via sequential introduction of lox sites. Scientific Reports., 2017, Vol. 7, no. 1, p. 7891.
  25. Hsu P.D., Scott D.A., Weinstein J.A., Ran F.A., Konermann S., Agarwala V., Li Y., Fine E.J., Wu X., Shalem O., Cradick T.J., Marraffini L.A., Bao G., Zhang F. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology., 2013, Vol. 31, no. 9, pp. 827–832.
  26. Jaric I., Voelkl B., Amrein I., Wolfer D.P., Novak J., Detotto C., Weber-Stadlbauer U., Meyer U., Manuella F., Mansuy I.M., Würbel H. Using mice from different breeding sites fails to improve replicability of results from single-laboratory studies. Lab Animal., 2024, Vol. 53, no. 1, pp 18–22.
  27. Koller B.H., Marrack P., Kappler J.W., Smithies O. Normal Development of Mice Deficient in beta 2M, MHC class I proteins, and CD8+ T cells. Science., 1990, Vol. 248, no. 4960, pp. 1227–1230.
  28. Lambertz R.L.O., Gerhauser I., Nehlmeier I., Gärtner S., Winkler M., Leist S.R., Kollmus H., Pöhlmann S., Schughart K. H2 influenza A virus is not pathogenic in Tmprss2 knock-out mice. Virology Journal., 2020, Vol. 17, no. 1 p. 56.
  29. Lee E.C., Liang Q., Ali H., Bayliss L., Beasley A., Bloomfield-Gerdes T., Bonoli L., Brown R., Campbell J., Carpenter A., Chalk S., Davis A., England N., Fane-Dremucheva A., Franz B., Germaschewski V., Holmes H., Holmes S., Kirby I., Kosmac M., Legent A., Lui H., Manin A., O'Leary S., Paterson J., Sciarrillo R., Speak A., Spensberger D., Tuffery L., Waddell N., Wang W., Wells S., Wong V., Wood A., Owen M.J., Friedrich G.A., Bradley A. Complete humanization of the mouse immunoglobulin loci enables efficient therapeutic antibody discovery. Nat Biotechnol., 2014, Vol. 32, no. 4, pp. 356-363.
  30. Li A., Coffey L.L., Mohr E.L., Raper J., Chahroudi A., Ausderau K.K., Aliota M.T., Friedrich T.C., Mitzey A.M., Koenig M.R., Golos T.G., Jaeger H.K., Roberts V.H.J., Lo J.O., Smith J.L., Hirsch A.J., Streblow D.N., Newman C.M., O'Connor D.H., Lackritz E.M., Van Rompay K.K.A., Adams Waldorf K.M. Role of non-human primate models in accelerating research and developing countermeasures against Zika virus infection. Lancet Microbe., 2025, Vol. 6, no. 6, p. 101030..
  31. Liu C., Xie W., Gui C., Du Y. Pronuclear microinjection and oviduct transfer procedures for transgenic mouse production. Methods Mol Biol., 2013, Vol. 1027, pp. 217-232.
  32. Longenecker G., Kulkarni A. B. Generation of gene knockout mice by ES cell microinjection. Current Protocols in Cell Biology., 2009, Vol. 44, no. 1, pp. 1-36.
  33. Lupiáñez D.G., Kraft K., Heinrich V., Krawitz P., Brancati F., Klopocki E., Horn D., Kayserili H., Opitz J.M., Laxova R., Santos-Simarro F., Gilbert-Dussardier B., Wittler L., Borschiwer M., Haas S.A., Osterwalder M., Franke M., Timmermann B., Hecht J., Spielmann M., Visel A., Mundlos S. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell., 2015, Vol. 161, no. 5, pp. 1012-1025.
  34. Marino M.W., Dunn A., Grail D., Inglese M., Noguchi Y., Richards E., Jungbluth A., Wada H., Moore M., Williamson B., Basu S., Old L.J. Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences., 1997, Vol. 94, no. 15, pp. 8093–8098.
  35. Masemann D., Ludwig S., Boergeling Y. Advances in transgenic mouse models to study infections by human pathogenic viruses. International Journal of Molecular Sciences., 2020, Vol. 21, no. 23, p. 9289.
  36. Miura H., Quadros R.M., Gurumurthy C.B., Ohtsuka M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols., 2017, Vol. 13, no. 1, pp. 195-215.
  37. Miyasaka Y., Uno Y., Yoshimi K., Kunihiro Y., Yoshimura T., Tanaka T., Ishikubo H., Hiraoka Y., Takemoto N., Tanaka T., Ooguchi Y., Skehel P., Aida T., Takeda J., Mashimo T. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics., 2018, Vol. 19, no. 1, p. 318.
  38. Monticelli S.R., Kuehne A.I., Bakken R.R., Coyne S.R., Lewis K.D., Raymond J.L.W., Zeng X., Richardson J.B., Lapoint Z., Williams J.L., Stefan C.P., Kugelman J.R., Koehler J.W., Herbert A.S. Characterization of a STAT-1 Knockout Mouse Model for Machupo Virus Infection and Pathogenesis. Viruses., 2025, Vol. 17, no. 7, p. 996.
  39. Moreau G.B., Burgess S.L., Sturek J.M., Donlan A.N., Petri W.A., Mann B.J. Evaluation of K18-hACE2 Mice as a Model of SARS-CoV-2 Infection. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene., 2020, Vol. 103, no. 3, pp. 1215–1219.
  40. Pincus S. H. Models of HIV infection utilizing transgenic and reconstituted immunodeficient mice. Drug Discovery Today: Disease Models., 2004, Vol. 1, no. 1, pp. 49–56.
  41. Ruiz S. I., Zumbrun E. E., Nalca A. Animal Models of Human Viral Diseases. Animal Models of Human Viral Diseases., 2017, pp. 853–901.
  42. Sarsani V.K., Raghupathy N., Fiddes I.T., Armstrong J., Thibaud-Nissen F., Zinder O., Bolisetty M., Howe K., Hinerfeld D., Ruan X., Rowe L., Barter M., Ananda G., Paten B., Weinstock G.M., Churchill G.A., Wiles M.V., Schneider V.A., Srivastava A., Reinholdt L.G. The Genome of C57BL/6J "Eve", the Mother of the Laboratory Mouse Genome Reference Strain. G3 (Bethesda)., 2019, Vol. 9, no. 6, pp. 1795–1805.
  43. Savenkova D.A., Gudymo A.S., Korablev A.N., Taranov O.S., Bazovkina D.V., Danilchenko N.V., Perfilyeva O.N., Ivleva E.K., Moiseeva A.A., Bulanovich Y.A., Roshchina E.V., Serova I.A., Battulin N.R., Kulikova E.A., Yudkin D.V. Knockout of the Tnfa Gene Decreases Influenza Virus-Induced Histological Reactions in Laboratory Mice. International Journal of Molecular Sciences., 2024, Vol. 25, no. 2, p. 1156.
  44. Smirnov A., Fishman V., Yunusova A., Korablev A., Serova I., Skryabin B.V., Rozhdestvensky T.S., Battulin N. DNA barcoding reveals that injected transgenes are predominantly processed by homologous recombination in mouse zygote. Nucleic Acids Research., 2019, Vol. 48, no. 2, pp. 719-735.
  45. Suzuki J., Inada H., Han C., Kim M.J., Kimura R., Takata Y., Honkura Y., Owada Y., Kawase T., Katori Y., Someya S., Osumi N. “Passenger gene” problem in transgenic C57BL/6 mice used in hearing research. Neuroscience Research., 2020, Vol. 158, pp. 6–15.
  46. Taft R. In Vitro Fertilization in Mice. Cold Spring Harbor Protocols., 2017., no. 11.
  47. Taft R.A., Davisson M., Wiles M.V. Know thy mouse. Trends in Genetics., 2006, Vol. 22, no. 12, pp. 649-653.
  48. Wang H., Yang H., Shivalila C.S., Dawlaty M.M., Cheng A.W., Zhang F., Jaenisch R. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell., 2013, Vol. 153, no. 4, pp. 910-918.
  49. Wu H., Haist V., Baumgärtner W., Schughart K. Sustained viral load and late death in Rag2-/- mice after influenza A virus infection. Virology Journal., 2010, Vol. 7, no. 1, p. 172.
  50. Zeldovich L. Genetic drift: the ghost in the genome. Lab Animal., 2017, Vol. 46, no. 6, pp. 255–257.
  51. Zhang C., Zaman L.A., Poluektova L.Y., Gorantla S., Gendelman H.E., Dash P.K. Humanized Mice for Studies of HIV-1 Persistence and Elimination. Pathogens., 2023, Vol. 12, no. 7, p. 879.
  52. Zijlstra M., Bix M., Simister N.E., Loring J.M., Raulet D.H., Jaenisch R. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature., 1990, Vol. 344, no. 6268, pp. 742–746.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Сметанникова Н.А., Давлетшина Г.И., Кораблев А.Н.,

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах