Email this article Effect of graphene oxide nanoparticles on viability of BAP3 hybridoma cells
- Authors: Lazarev S.S.1,2, Bochkova M.S.1,2, Timganova V.P.2, Rayev M.B.1,2
-
Affiliations:
- Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Branch of Perm Federal Research Center
- Perm State University
- Issue: Vol 25, No 3 (2022)
- Pages: 245-250
- Section: SHORT COMMUNICATIONS
- URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/1148
- DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-1148-EOG
- ID: 1148
Cite item
Full Text
Abstract
Graphene oxide (GO) is a promising material, which is likely to find applications in the fields of medicine and biotechnology. However, the current knowledge of its influence on human organism is limited. Even less information is available on the effects of GO on the cell lines widely used in biotechnology. The aim of this work is to describe the interaction between GO nanoparticles and BAP3 hybridoma cells which produce anti-human-PSG1 IgG, in vitro. We studied the effect of GO nanoparticles on cell viability and the intensity of internalization (adhesion) of nanoparticles by the cells. We used GO nanoparticles of different size, with surface being functionalized by linear or branched PEG (GO-PEG). The PEG coating level was 20% (by mass). The following nanoparticle concentrations were used: 5 μg/mL and 25 μg/mL. The BAP3 cells were cultured in a 48-well cell culture plates in serum-free DCCM-1 media in the presence of GO nanoparticles. The cells were cultured for 24 hours at 37 °С and 5% СО2. Cell viability was assessed by a flow cytometer utilizing Zombie Aqua (ZA) staining. Internalization (adhesion) of nanoparticles was monitored using a flow cytometer by GO fluorescense in the samples (λex = 488 nm). Moreover, interactions between hybridoma cells and GO nanoparticles were visualized by EVOS M5000 visualization system, which included an inverted fluorescent microscope.
We demonstrated that GO nanoparticles possess a cytotoxic effect when applied at high concentration (25 μg/mL). The highest cytotoxic effect is caused by GO nanoparticles coated with linear PEG. The degree of nanoparticle internalization (adhesion) was shown to be significantly lower when the particles were present at lower (5 μg/mL) concentration. Internalization (adhesion) of nanoparticles of smaller size was more abundant. Furthermore, these nanoparticles were shown to have a stronger cytotoxic effect compared to larger particles. In general, cytotoxicity of GO nanoparticles decreases with increasing size, which is especially evident if the fact that the mean effective diameter of the nanoparticles coated with branched PEG is considered larger than their linear PEG-coated counterparts. The data obtained allow us to draw a correlation between the cytotoxic effect of GO nanoparticles and the level of their internalization (adhesion) by the cells. In general, this work concerns some novel aspects of interaction between GO nanoparticles and hybridoma cells.
Full Text
Введение
Благодаря своим уникальным свойствам графен все чаще находит применение в биомедицине. В частности, оксид графена (ОГ) в настоящее время исследуется для применения в таких сферах биомедицины, как доставка лекарств и медицинская визуализация [5]. Применение материалов на основе графена в медицине требует тщательной оценки их биосовместимости и детального понимания их взаимодействия с клетками. Как известно, различные поверхностные модификации ОГ могут снижать цитотоксические эффекты в отношении клеток [2]. Кроме того, одним из самых распространенных материалов для функционализации ОГ является полиэтиленгликоль (ПЭГ) [6]. В нашей работе мы использовали частицы ОГ, модифицированного разветвленным и неразветвленным ПЭГ.
Данное исследование является частью большого проекта по изучению биосовместимости наночастиц ОГ с клетками иммунной системы [https://grant.rscf.ru/prjcard_int?19-15-00244]. Гибридомы используются для продукции моноклональных антител определенной специфичности. Гибридома BAP3 (Genovac, Германия) была получена из плазматических клеток селезенки мыши и продуцирует IgG к трофобластическому бета-1-гликопротеину человека. Известно, что клетки гибридомы быстро пролиферируют и обладают характеристиками, сходными с плазматическими клетками мыши [4]. Таким образом, они представляют собой адекватную модель для изучения влияния различных веществ на плазматические клетки.
Целью нашего исследования стало изучение процессов взаимодействия наночастиц ОГ с клетками гибридомы BAP3 в условиях in vitro. В работе применяли наночастицы разного размера, функционализированные линейным или разветвленным ПЭГ, изучая как жизнеспособность клеток, так и поглощение частиц этими клетками.
Материалы и методы
Функционализация наночастиц ОГ
В работе использовались наночастицы ОГ размерами 100-200 нм (ОГм) и 1-5 мкм (ОГб) (Ossila Ltd, Великобритания), которые покрывались линейным (П) и разветвленным (рП) полиэтиленгликолем (ПЭГ). Процедуры модификации и характеристика наночастиц описаны нами ранее [3]. Таким образом, в работе применялись следующие частицы: П-ОГм (Ø 184±73 нм), рП- ОГм (Ø 287±52 нм), П-ОГб (Ø 569±14 нм), рП-ОГб (Ø 1376±48 нм).
Подготовка культуры клеток гибридомы BAP3
Для исследования in vitro использовали клетки гибридомы ВАР3 (Genovac, Германия), производящей IgG, специфичные к трофобластическому бета-1-гликопротеину человека. Клетки гибридомы BAP3 хранили в криохранилище при температуре жидкого азота (количество клеток в каждой пробирке – 3-5 × 106) в среде заморозки (эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС) (BI, Израиль) + 10% диметилсульфоксид (ДМСО) (Sigma, США)). Клетки были разморожены согласно протоколу производителя (Genovac, Германия). После размораживания клетки были перенесены в 48-луночный планшет (Сorning, США) для культивирования в средe роста (среда DMEM с высоким содержанием глюкозы (BI, Израиль) + 12% (ЭТС) (BI, Израиль)) в течение 48 часов в СО2-инкубаторе IG-150 Jouan (Франция) при концентрации СО2 5%. После этого клетки были перенесены в T75 культуральные фласки (Cellstar®, Германия) с бессывороточной средой DCCM-1 (BI, Израиль) с добавлением 3,3 мМ L-глутамина, 67 Ед/мл пенициллина, 0,07 мг/мл стрептомицина, 0,17 мкг/мл амфотерицина B, 1 мМ пирувата натрия (BI, Израиль).
Клетки культивировали во фласках в течение недели для формирования стабильной культуры перед внесением наночастиц ОГ. Ежедневно проводили подсчет количества клеток, проверяли их жизнеспособность, при необходимости производили замену среды. Подсчет и проверку жизнеспособности клеток осуществляли в гемоцитометре Нейбауэра, в тесте с трипановым синим (0,2%; Sigma, США).
Оценка взаимодействия клеток гибридомы с наночастицами ОГ
Для оценки влияния ОГ на жизнеспособность гибридомы BAP3, клетки вносили в концентрации 2 × 105 кл/мл в 48-луночные планшеты (Сorning, США). Далее в лунки добавляли наночастицы ОГ разных размеров, функционализированные линейным или разветвленным ПЭГ (П-ОГм, рП-ОГм, П-ОГб, рП-ОГб) до конечных концентраций 5 и 25 мкг/мл. Культуры инкубировали в течение суток при 37 °C и 5% CO2 (для оценки влияния ОГ на жизнеспособность клеток гибридомы). Для каждого вида наночастиц ОГ делали три повторности культуры, контролем служила культура клеток без наночастиц ОГ.
После инкубации была произведена оценка жизнеспособности клеток с помощью суправитального красителя Zombie Aqua (ZA) на проточном цитометре (Cytoflex S, Beckman Coulter, США). Кроме того, оценивали количество клеток, интернализовавших (адгезировавших) наночастицы ОГ, по интенсивности флуоресценции клеток (λex = 488 nm; bandpass filter: 720-840 nm; фильтр для красителя PC-7). Также нами была использована система визуализации (EVOS M5000, Thermo Fisher Scientific, США) для получения снимков каждого типа культур в лунках.
Обработку данных проточной цитометрии осуществляли в программе KALUZA Analysis Software (Beckman Coulter, США), результаты выражали в виде процента живых (не окрашенных Zombie Aqua) клеток в гейте целевой популяции, и в виде процента клеток, флуоресцирующих в канале для красителя PC-7 (при оценке интернализации/адгезии) наночастиц.
Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью Graphpad Prism 8. Данные представлены в арифметических средних со стандартными отклонениями (M±σ), достоверность различий оценивали с использованием критерия ANOVA с тестом для множественных сравнений Сидака. Различия считались достоверными при уровне значимости р < 0,05. Для частиц в высокой концентрации был вычислен коэффициент R2 (Пирсона) для корреляции между размером частиц и долей жизнеспособных клеток.
Результаты и обсуждение
- Обнаружено, что частицы П-ОГм в низкой и высокой концентрациях действовали цитотоксически на клетки гибридомы BAP3, так как количество живых клеток в культурах статистически значимо снижалось (рис. 1А). Остальные частицы оказывали цитотоксический эффект только в высокой концентрации 25 мкг/мл. Интересно, что ОГ в высокой концентрации, функционализированный разветвленным ПЭГ (рП-ОГм и рП-ОГб), оказывал меньший цитотоксический эффект по сравнению с ОГ, покрытым линейным ПЭГ (рис. 1А).
Таким образом, наночастицы ОГ способны оказывать цитотоксический эффект на клетки гибридомы BAP3 в высокой концентрации (25 мкг/ мл), независимо от размера и типа ПЭГ, которыми они покрыты. В то же время только частицы малого размера (П-ОГм) способны оказывать цитотоксический эффект в низкой концентрации (5 мкг/мл). Для частиц в высокой концентрации коэффициент R2 для корреляции между размером частиц и долей жизнеспособных клеток в культуре равен 0,83 (p < 0,05). Цитотоксичность частиц уменьшается с увеличением их размера.
Рисунок 1. Взаимодействие наночастиц ОГ с клетками гибридомы
Примечание. А – процент жизнеспособных клеток в культурах гибридомы BAP3 с разными видами наночастиц ОГ в двух концентрациях. Для всех групп n = 3. Числами обозначены значения p < 0,05 по отношению к контролю без ОГ и по отношению к частицам ОГ, покрытым неразветвленным ПЭГ.
Б – Процент флуоресцирующих (интернализовавших/адгезирующих ОГ) клеток в суточных культурах клеток гибридомы BAP3. Для всех групп n = 3. Числами обозначены значения p < 0,05 (ANOVA) показателей культур с большими наночастицами ОГ по отношению к культурами с малыми наночастицами ОГ с аналогичным покрытием (видом ПЭГ).
Figure 1. Interaction of GO nanoparticles and hybridoma cells
Note. (A) Percentage of viable BAP3 hybridoma cells in cultures with different types of GO nanoparticles added in two concentrations. For all groups n = 3. P-values < 0.05 as compared to the control group and to the GO nanoparticles functionalized with linear PEG are indicated by numbers.
(B) Percentage of cells exhibiting fluorescense in 24 h BAP3 hybridoma cell cultures. Note: for all groups n = 3. P-values indicate the difference (ANOVA) between samples with large nanoparticles and samples with small nanoparticles of the same PEG coating type.
При оценке интернализации (адгезии) частиц клетками гибридомы BAP3 обнаружено, что в концентрации 5 мкг/мл частицы практически не интернализовались, однако концентрация наночастиц ОГ 25 мкг/мл способствовала их интенсивной интернализации (адгезии) клетками гибридомы, о чем говорит повышение процента флуоресцирующих клеток (рис. 1Б). Однако тип ПЭГ, использованный для покрытия частиц ОГ, не влиял на этот параметр. Известно, что опухолевые линии клеток, могут интернализовать наночастицы различными способами [1]. Статистически значимые различия в процентах флуоресцирующих клеток между культурами с ОГ с одинаковым покрытием, но разными размерами, говорит о том, что мелкие частицы клетками гибридомы адгезируются/интернализуются лучше, чем большие (рис. 1Б). Цитотоксический эффект наночастиц мы связываем с ER-стрессом, вызванный интернализацией наночастиц клетками гибридомы.
Рисунок 2. Визуализация взаимодействия клеток гибридомы BAP3 и наночастиц ОГ
Примечание. П – линейный ПЭГ, рП – разветвленный ПЭГ, ОГм – частицы малого размера, ОГб – частицы большого размера.
Figure 2. Visualization of interaction between BAP3 hybridoma and GO nanoparticles
Note. P, linear PEG; bP, branched PEG; GOs, small particles; GOb, large particles.
Заключение
При изучении влияния наночастиц ОГ на клетки гибридомы BAP3 было показано, что частицы оказывали цитотоксический эффект в высокой концентрации 25 мкг/мл, при этом цитотоксический эффект уменьшался с увеличением размера частиц. При оценке интернализации (адгезии) частиц клетками гибридомы BAP3 обнаружено, что в концентрации 5 мкг/мл частицы практически не интернализовались, однако, концентрация наночастиц ОГ 25 мкг/мл способствовала их интенсивной интернализации (адгезии) клетками гибридомы. Таким образом, полученные данные позволяют связать оказываемый наночастицами ОГ цитотоксический эффект с их интернализацией (адгезией) клетками. В целом впервые изучены некоторые аспекты взаимодействия наночастиц ОГ с клетками гибридомы.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РНФ в рамках научного проекта № 19-15-00244-П.
About the authors
S. S. Lazarev
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Branch of Perm Federal Research Center; Perm State University
Author for correspondence.
Email: lasest@vk.com
Engineer, Laboratory of Ecological Immunology; Bachelor, Department of Microbiology and Immunology
Russian Federation, Perm; PermM. S. Bochkova
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Branch of Perm Federal Research Center; Perm State University
Email: lasest@vk.com
PhD (Biology), Research Associate, Laboratory of Ecological Immunology; Senior Lecturer, Department of Microbiology and Immunology
Russian Federation, Perm; PermV. P. Timganova
Perm State University
Email: lasest@vk.com
PhD (Biology), Research Associate, Laboratory of Ecological Immunology
Russian Federation, PermM. B. Rayev
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Branch of Perm Federal Research Center; Perm State University
Email: lasest@vk.com
PhD, MD (Biology), Leading Research Associate, Laboratory of Ecological Immunology; Professor, Department of Microbiology and Immunology
Russian Federation, Perm; PermReferences
- Behzadi S., Serpooshan V., Tao W., Hamaly M.A., Alkawareek M.Y., Dreaden E.C., Brown D., Alkilany A.M., Farokhzad O.C., Mahmoudi M. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chem. Soc. Rev., 2017, Vol. 46, no. 14, pp. 4218-4244.
- de Melo-Diogo D., Lima-Sousa R., Alves C.G., Costa E.C., Louro R.O., Correia I.J. Functionalization of graphene family nanomaterials for application in cancer therapy. Colloids Surf. B Biointerfaces, 2018, Vol. 171, pp. 260-275.
- Khramtsov P., Bochkova M., Timganova V., Nechaev A., Uzhviyuk S., Shardina K., Maslennikova I., Rayev M., Zamorina S. Interaction of graphene oxide modified with linear and branched PEG with monocytes isolated from human blood. Nanomaterials, 2022, Vol. 12, no. 1, 126. doi: 10.3390/nano12010126.
- Mitra S., Tomar P.C. Hybridoma technology; advancements, clinical significance, and future aspects. J. Genet. Eng. Biotechnol., 2021, Vol. 19, no. 1, 159. doi: 10.1186%2Fs43141-021-00264-6.
- Shareena T.P.D., McShan D., Dasmahapatra A.K., Tchounwou P.B. A review on graphene-based nanomaterials in biomedical applications and risks in environment and health. Nanomicro Lett., 2018, Vol. 10, no. 3, 53. doi: 10.1007/s40820-018-0206-4.
- Singh D.P., Herrera C.E., Singh B., Singh S., Singh R.K., Kumar R. Graphene oxide: An efficient material and recent approach for biotechnological and biomedical applications. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl., 2018, Vol. 86, pp. 173-197.
Supplementary files
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).