In vitro  effects of recombinant IFNα2B on the content of antigen-presenting CD66b + CD16 + CD33 + HLA - DR +  subset of neutrophils in children with acute osteomyelitis

I. V. Nesterova; Нестерова И. В.; Galina A. Chudilova; Чудилова Галина Анатольевна; Yu. V. Teterin; Тетерин Ю. В.; E. A. Chicherev; Чичерев Е. А.; V. N. Chapurina; Чапурина В. Н.; V. A. Tarakanov; Тараканов В. А.; N. K. Barova; Барова Н. К.

doi:10.46235/1028-7221-13769-IVE

In vitro effects of recombinant IFNα2B on the content of antigen-presenting CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA^-DR⁺ subset of neutrophils in children with acute osteomyelitis

Authors: Nesterova I.V.¹^,2, Chudilova G.A.¹, Teterin Y.V.¹, Chicherev E.A.¹, Chapurina V.N.¹, Tarakanov V.A.¹, Barova N.K.¹
Affiliations:
1. Kuban State Medical University
2. P. Lumumba Peoples’ Friendship University
Issue: Vol 26, No 4 (2023)
Pages: 689-696
Section: Forum Sochi 2023
Submitted: 09.07.2023
Accepted: 12.07.2023
Published: 22.09.2023
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/13769
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-13769-IVE
ID: 13769

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Negative impact of S. aureus, seems to be a sufficient condition for the spread of the infectious process in the bone in acute osteomyelitis (AOM) due to its altered elimination caused by dysfunction of the immune system (IS), in particular, of neutrophilic granulocytes (NG). Correction of NG dysfunction in AOM under the influence of immunotropic substances and cytokines via modulation of the NG phenotypic subsets is of sufficient interest. Our aim was to evaluate the in vitro effects of recombinant IFNá2b on the number and phenotype of CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-, CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ subsets and on phagocytic function of neutrophilic granulocytes in acute osteomyelitis in children.

The study of peripheral blood (PB) samples from children aged 8-15 years was carried out as follows: patients with АOM (n = 24) comprised study group 1 (SG1), healthy children (n = 13) were included into comparison group (CG). PB samples of children with AOM were incubated with recIFNá2b (50 IU/µL, 60 min, 37 °C.) in the study group 1a (SG1a). Before and after incubation with recIFNá2b, the number of NG subsets CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-, CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ and the density values of receptor expression by fluorescence intensity (MFI) were also determined (FC 500, Beckman Coulter, США). Phagocytic activity of NCs was evaluated as the contents of actively phagocytic NCs (%PhAN), volume of the engulfed S. aureus (strain 209) by assessing their phagocytic number (PhN), phagocytic index (PhI). Bacterial killing was determined as the percentages of microbe digestion (%D), digestion index (DI).

The cells from AOM patients revealed a subset expressing the HLA-DR receptor – СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺NG, which is absent in the PB of CG children. The cells with primed phenotype exhibited an increased expression density of activation receptors CD16 and CD66b. Incubation of PB in AOM with recIFNá2b led to an increased proportion of CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ NG subset which showed active phagocytosis and improved digestion processes. The present study shows the emergence of activated subset of “long-lived” CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ NCs in children with AOM. This subpopulation has APC features, by presenting AG to T lymphocytes, with preserved effector properties. In an in vitro experimental system, a positive effect of recIFNá2b was demonstrated, leading to an increased number of NGs of the CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ subset and recovery of S. aureus phagocytosis by NGs, thus being promising in the future for development of new approaches to optimization of complex therapy in the postoperative period of AOM treatment, prevention of complications and the opportunity to alleviate the disorders in the immune system.

Keywords

acute osteomyelitis, children, neutrophilic granulocytes, antigen-stimulating subpopulation, recombinant IFNα2b, phenotype

Full Text

Исследование выполнено в рамках государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации № 121031000071-4.

Введение

Остеомиелит (ОМ) – гнойно-некротический процесс, развивающийся в кости и костном мозге (КМ), под воздействием высоко специфического патогенна S. aureus. S. aureus способен внедряться, колонизировать и размножаться в костной ткани, продуцируя факторы вирулентности: деградация тканей хозяина, прилипание к компонентам внеклеточного матрикса, образование биопленок, для уклонения от уничтожения фагоцитами [1, 2]. В ответ на это вырабатываются хемокины CXCL8, IL-1β, CXCL2 и CCL3, которые привлекают и активируют большое количество НГ, создавая воспалительную микросреду, которая способствует образованию костно-резорбирующих остеокластов. Важнейшим условием распространения инфекционного процесса в кости является как негативное влияние самого S. aureus, так и нарушение его элиминации из-за дисфункции иммунной системы (ИС) и, в первую очередь, нейтрофильных гранулоцитов (НГ) [1, 15].

НГ являются фенотипически и функционально гетерогенными клетками, которые не только эффективно уничтожают патогены посредством фагоцитоза, продукции антимикробных пептидов, активных форм кислорода, секреции провоспалительных цитокинов и хемокинов, образования нейтрофильных экстрацеллюлярных сетей (NET), но и участвуют в перекрестных взаимодействиях с другими популяциями лейкоцитов, обеспечивая связь между врожденным и адаптивным иммунитетом [5, 10].

Показано, что НГ КМ, подвергшиеся воздействию GM-CSF, IL-3, TNFα, интерферонами (IFNγ) и бактериальными продуктами, экспрессируют на своей поверхности молекулы HLA класса II (MHC-II), дифференцируются в гибриды нейтрофил-DC, демонстрируя DC-подобный фенотип и антигенпрезентирующую функцию, сохраняя при этом свойства НГ [10, 13]. НГ могут влиять на адаптивный иммунный ответ, модулируя ответы CD4⁺Т-клеток через молекулы MHC-II [9]. Кроме того, рецептор CD66b, экспрессируемый исключительно на НГ, может функционировать как рецептор для галектина-3, который экспрессируется CD4⁺Т-клетками памяти, на низком уровне – наивными Т-клетками [9]. Взаимодействия рецептор-лиганд между Т-клетками памяти и НГ инициируют экспрессию MHC-II на мембране НГ, происходит дальнейшая амплификация лигирования MHC-TCR, в результате активируется большее количество Т-клеток, секретирующих цитокины, вызывающие увеличение экспрессии MHC-II на мембране НГ. Эта петля положительной обратной связи может играть центральную роль в индукции и поддержании презентации антигена НГ [9]. Установлено, что субпопуляции НГ, экспрессирующие HLA-DR, дополнительно экспрессируют ко-рецепторы CD80 и CD49d и характеризуются значительно увеличенной продолжительностью жизни. При этом «долгоживущие» НГ HLA- DR⁺ содержат больше миелопероксидазы (MPO), у них повышены фагоцитарный индекс и адгезия, их отличает ограниченная способность к хемотаксису и экзоцитозу первичных и вторичных гранул по сравнению с НГ-HLA-DR^-[4]. При ООМ у детей нами была определена антигенпрезентирующая субпопуляция НГ CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA- DR^+, экспрессирующая высокоспецифические маркеры НГ (CD66b, CD16, CD33) и позитивная по HLA- DR [11].

CD66b (CEACAM8), GPI-заякоренный гликопротеин суперсемейства Ig, экспрессируется исключительно на НГ со стадии промиелоцитов, – маркер активации НГ [7]. CD16 (FcγRIII) рецептор – маркер палочкоядерных и сегментированных НГ и их активации. При контакте с антигеном происходит быстрая транслокация рецептора из цитоплазматического депо НГ на его поверхность. Повышенная экспрессия мембранных CD16 на НГ свидетельствует об активации клетки, а сниженная экспрессия или полное отсутствие CD16 характеризует незрелость НГ и/ или «обратную дифференцировку» клетки, которая наблюдается при тяжелых бактериальных инфекциях или некрозах тканей [5]. CD33 (Siglec-3), принадлежит суперсемейству Ig, содержит два домена (IgV и IgC2) – маркер дифференцировки миелоидных клеток. Плотность экспрессии CD33 постепенно снижается от стадии миелобластов до сегментоядерных НГ. Внутриклеточная часть CD33 содержит ингибиторные мотивы на основе тирозина (ITIM), которые участвуют в ингибировании клеточной активности [8].

Следует подчеркнуть, что HLA-DR, который экспрессируется на миелобластах, отсутствует на зрелых НГ, но экспрессируется на поверхности тканевых НГ при хронических воспалительных состояниях [14]. Иммунный ответ на бактерии в костях имеет уникальные особенности по сравнению с другими инфицированными тканями и значительно модифицируется локальными факторами. Повышенная активация и функциональная способность НГ-HLA-DR⁺ предполагает наличие праймированного фенотипа [4], в связи с этим интерес представляет оценка возможности влияния на уровень экспрессии поверхностных рецепторов альтернативными инициирующими сигналами, в т. ч. на экспрессию HLA-DR НГ с целью возможной корректировки функций НГ.

Цель исследования – уточнить эффекты влия- ния рекомбинантного IFNα2b на количество и фе- нотип субпопуляций CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-, CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ и фагоцитарную функцию нейтрофильных гранулоцитов при остром остеомиелите у детей в системе in vitro.

Материалы и методы

Проведено исследование образцов периферической крови (ПК) 24 детей с острым (ООМ) 8-15 лет – группа исследования 1 (ГИ1). Группу сравнения (ГС) составили образцы ПК 13 здоровых детей в возрасте 8-15 лет.

Для оценки влияния рекомбинантного IFNα2b образцы ПК детей с ООМ инкубировали с рекIFNα2b (50 МЕ/мкл, 60 мин, 37 °С) – группа исследования 1а (ГИ1а).

До и после инкубации с рекIFNα2b определяли количество НГ субпопуляций CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺, CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- и плотность экспрессии рецепторов по интенсивности флюоресценции (MFI) (FC 500, Beckman Coulter, США), фагоцитарную активность НГ по содержанию активно-фагоцитирующих НГ (%ФАН), объему захваченного бактериального патогена S. aureus (штамм 209) по показателям – фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ); для оценки киллинговой активности – процент переваривания (%П), индекс переваривания (ИП).

У всех законных представителей пациентов было получено информированное согласие на участие в исследовании и забор крови согласно WMA Declaration of Helsinki – Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects, 2013). Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава РФ.

Статистическая обработка данных проводилась компьютерной программой Microsoft Excel 2016 и StatPlus 2020. После оценки нормальности распределения лабораторных показателей использовали критерии Вилкоксона–Манна–Уитни. Представление результатов в виде медианы (верхний и нижний квартиль) – Me (Q_0,25-Q_0,75). Определение статистически значимых различий при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Установлено, что в ПК условно-здоровых детей ГС регистрируется субпопуляция CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- доля которой составляет 98,8 (98,0-100)%. Фенотип данной субпопуляции: низкая плотность экспрессии маркеров НГ по MFI CD66b – 4,6 (4,2-5,0), CD33 – 3,7 (3,3-4,6) и средние значения MFI CD16 – 81,45 (69,3-99,2), характеризует зрелые палочкоядерные и сегментоядерные НГ [3].

В ПК ГИ1 детей с ООМ показано снижение в 1,4 раза доли НГ субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- до 71,2 (62,5-78,5)% относительно 98,8 (98,0-100)% в ГС (р < 0,05). При этом наблюдалась увеличение плотности экспрессии рецепторов по MFI CD16 до 114,5 (100,3- 139,0) против 81,45 (69,3-99,2) и CD66b до 6,2 (5,7-7,3) против 4,6 (4,2-5,0) (р_{1, 2} < 0,05) и неменяющемся MFI CD33- 2,9 (2,5-3,4) (р > 0,05) относительно ГС, дополнительная транслокация внутриклеточных резервных пулов CD16, CD66b рецепторов на мембрану демонстрирует активированный фенотип НГ, способных к дегрануляции, окислительный взрыву и фагоцитозу НГ [4] (табл. 1).

ТАБЛИЦА 1. СОДЕРЖАНИЕ И ФЕНОТИП СУБПОПУЛЯЦИЙ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- И СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ ПРИ ОСТРОМ ОСТЕОМИЕЛИТЕ ДО И ПОСЛЕ ИНКУБАЦИИ СИСТЕМЕ IN VITRO С РЕКОМБИНАНТНЫМ IFNα2b, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 1. CONTENT AND PHENOTYPE OF CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- AND CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ NEUTROPHILIC GRANULOCYTE SUBSETS IN ACUTE OSTEOMYELITIS BEFORE AND AFTER IN VITRO INCUBATION WITH RECOMBINANT IFNα2b, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Показатели

Indicators

Группа сравнения

Comparison group

n = 13

Группа исследования 1

до инкубации с рекIFNα2b

Study group 1

before incubation with recIFNα2b

n = 24

Группа исследования 1а

после инкубации с рекIFNα2b

Study group 1a

after incubation with recIFNα2b

n = 24

СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-

НГ, %

NG, %

98,8

(98,0-100,0)

71,2*

(62,5-78,5)

49,0* ^

(41,4-61,1)

MFI CD66b

4,6

(4,2-5,0)

6,2

(5,7-7,3)

8,7* ^

(7,6-8,9)

MFI СD16

81,5

(69,3-99,2)

114,5

(100,3-139,0)

104,7

(74,3-119,9)

MFI CD33

3,7

(3,3-4,6)

2,9

(2,5-3,4)

2,5*

(2,1-2,5)

СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺

НГ, %

NG, %

29,9*

(18,4-37,6)

45,0* ^

(38,9-58,9)

MFI CD66b

8,20

(6,5-9,0)

8,7

(7,6-8,9)

MFI СD16

112,5

(100,3-137,0)

104,0

(73,7-120,8)

MFI CD33

3,5

(3,3-4,2)

3,5

(2,8-3,8)

HLA-DR

2,2

(1,8-4,0)

1,6

(1,5-2,0)

Примечание. * – значимые различия между показателями группы сравнения и группы исследования (ООМ), p < 0,05; ^ – значимые различия между показателями группы исследования до и после инкубации in vitro c рекIFNα2b, p < 0,05.

Note. *, significant differences between the indicators of the comparison group and the study group (AOM) p < 0.05; ^, significant differences between the parameters of the study group before and after in vitro incubation with recIFNα2b, p < 0.05.

В то же время при ООМ была выявлена субпопуляция экспрессирующая HLA-DR рецептор – СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺НГ, отсутствующая в ПК детей ГС, доля которой составила 29,9 (18,4-37,6)%. Плотность экспрессии была определена по MFI HLA-DR – 2,2 (1,8-4,0), MFI CD33 – 3,5 (3,3-4,2), при этом плотность экспрессии рецепторов CD66b и CD16 была сопоставима с показателями субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-НГ (табл. 1).

Инкубация ПК ГИ1 при ООМ с рекIFNα2b приводила к перераспределению доли содержания субпопуляций CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-, CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ (табл. 1).

Отмечалось снижение количества НГ субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- – 49,0 (41,4-61,1) % против 71,2 (52,5-80,5) % до инкубации (р > 0,05). При этом выявлено увеличение плотности экспрессии в 1,3 раза CD66b – 8,7 (7,6-8,9) против 6,23 (5,7-7,3) в ГИ1 (р < 0,05) и снижение MFI CD33 до 2,5 (2,1-2,5) против 2,9 (2,5-3,4) до инкубации (р < 0,05). Выявлено отсутствие эффектов влияния рекIFNα2b по отношению к MFI CD16 рецепторов (табл. 1).

При этом определялось более высокое количество НГ субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ – 45,0 (38,9-58,9) % против 29,9 (18,4-37,6) %. (р < 0,05) в ГИ1 до инкубации с рекIFNα2b. С плотностью экспрессии рецепторов CD66b, CD16, CD33 и HLA-DR не отличающихся от значений ГИ1 до инкубации (р_1-4 > 0,05) (табл. 1).

При исследование фагоцитарной функции после инкубации с рекIFNα2b НГ в ГИ1а с ООМ в системе in vitro отмечено повышение %ФАГ до 76,0 (70,0-77,0) % против 51,0 (42,8-58,3) % (р < 0,05) в группе исследования и 54,7 (51,0-57,0) % в группе сравнения (р < 0,05). Также установлено увеличение киллинговой способности НГ с 41,9 (37,8-44,8) % в группе исследования с ООМ до 57,4 (53,6-61,1) % (р < 0,05), т. е. практически до показателей группы сравнения 64,5 (62,6-66,9) (р < 0,05) (табл. 2).

ТАБЛИЦА 2. ЭФФЕКТЫ ВЛИЯНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО IFNα2b НА ФАГОЦИТАРНУЮ ФУНКЦИЮ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПРИ ОСТРОМ ОСТЕОМИЕЛИТЕ IN VITRO, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 2. EFFECTS OF RECOMBINANT IFNα2b ON THE PHAGOCYTIC FUNCTION OF NEUTROPHILIC GRANULOCYTES IN ACUTE OSTEOMYELITIS IN VITRO, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Показатели

Indicators

Группа сравнения

Comparison group

n = 13

Группа исследования 1

до инкубации

с рекIFNα2b

Study group 1

before incubation with recIFNα2b

n = 24

Группа исследования 1а после инкубации

с рекIFNα2b

Study group 1a

after incubation with recIFNα2b

n = 24

%ФАН

%PhAN

54,7

(51,0-57,0)

51,0

(42,8-58,3)

76,0* ^

(70,0-77,0)

ФЧ

PhN

4,4

(3,8-4,7)

1,9*

(1,7-2,3)

2,7*

(2,2-3,5)

ФИ

PhI

1,9

(1,7-2,2)

1,0*

(0,9-1,5)

2,0

(1,5-2,7)

%П

64,5

(62,6-66,9)

41,9*

(37,8-44,8)

57,4* ^

(53,6-61,1)

ИП

1,7

(1,5-2,0)

0,5*

(0,3-0,7)

0,9*

(0,5-1,4)

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

Таким образом, данные полученные в результате проведенного эксперимента in vitro продемонстрировали возможность позитивного влияния рекIFNα2b на функционирование НГ при ООМ. Установлено повышение содержания субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ «долгоживущих» НГ, обладающих уникальным профилем DC-подобных клеток с антигенпрезентирующей функцией, которые, по литературным данным, способны презентировать суперантиген Staphylococcus enterotoxin E (SEE) Т-клеткам, связываясь с молекулами MHC II класса [6]. «Долгоживущие» НГ, обладающих уникальным профилем DC-подобных клеток, продуцируют значительные количества IL-8, IL-1β, рецепторного антагониста IL-1, при этом не только сохраняя, но и усиливая эффекторные свойства коротокоживущих НГ [3].

Результаты исследования также подтверждают гипотезу о способности НГ трансформироваться с «классического» фенотипа на фенотип «долгоживущих нейтрофилов» под влиянием от экстрацеллюлярного окружения клеток [3]. Детекция новой антигенпредставляющей субпопуляции НГ со смешанным нейтрофильно-дендритным фенотипом при остром остеомиелите у детей, возможно, связано с гнойно-инфекционным процессом, затрагивающим не только костные ткани, но и костный мозг. При этом следует отметить, что ранее появление молекул CD66b и HLA-DR на мембране НГ наблюдали только при хронических инфекционно-воспалительных заболеваниях (лейшманиоз) и аутоиммунных процессах (грануломатоз Вегенера и ревматоидный артрит) [4]. Выявленный нами эффект позитивного влияния IFNα2b в системе in vitro демонстрирует пластичность субпопуляций СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA- DR⁺ СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR: их трансформацию в сторону увеличения, субпопуляции с антигенпрезентирущими свойствами, что необходимо, с нашей точки зрения, для достижения полноценной регрессии гнойного воспалительного процесса.

Заключение

В настоящем исследовании показано появление у детей с ООМ активированной субпопуляции «долгоживущих» НГ СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA- DR⁺ со свойствами АПК представляющими АГ Т-лимфоцитам [12] с сохраняющимися эффекторными свойствами.

В экспериментальной системе in vitro, продемонстрировано позитивное влияние рекIFNα2b, приводящее к увеличению количества НГ субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ и восстановлению фагоцитарной функции НГ по отношению к S. aureus, что может быть использовано в будущем разработки новых подходов к оптимизации комплексной терапии в послеоперационном периоде лечения ООМ, профилактике осложнений и возможности реставрации нарушений в иммунной системе.

About the authors

I. V. Nesterova

Kuban State Medical University; P. Lumumba Peoples’ Friendship University

Email: inesterova1@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5339-4504
SPIN-code: 4714-2488
Scopus Author ID: 56553330300

PhD, MD (Medicine), Professor, Chief Research Associate, Department of Clinical and Experimental Immunology and Molecular Biology, Central Scientific Research Laboratory, Kuban State Medical University, Krasnodar; Professor, Department of Clinical Immunology, Allergology and Adaptology, Medical Institute, P. Lumumba Peoples’ Friendship University

Russian Federation, Krasnodar; Moscow