Hormone-producing role of mast cells in reproductive processes: myth or reality?

Full Text

Введение

Роль клеток иммунной системы, в том числе тучных клеток (ТК, мастоциты) в механизмах возникновения и прогрессирования дисфункции эндокринной системы исследуется достаточно давно, но ясного представления об их участии так и не получено [3, 7, 8, 12, 13]. В последние годы появились новые данные об участии ТК в развитии аутоиммунных и онкологических заболеваний, в регуляции иммунитета и воспаления [2, 12]. Более того, доказательство продукции ряда гормонов ТК не внесло ясности в понимание – позитивно или негативно сказывается этот синтез гормонов ТК на продукцию гормонов эндокриноцитами из микроокружения и служит ли исключительно коммуникативным целям или тем самым ТК активируют высокоспециализированные клетки иммунной системы и каков механизм этой активации.

Так, в экспериментальной животной модели было представлено, что в эндометриоидных очагах плотность ТК выше, как и их количество в перитонеальной жидкости, в сравнении со здоровыми животными [7]. Выявлено снижение ТК и увеличение эозинофилов при синдроме поликистозных яичников [8]. Об участии гистамина, продукта дегрануляции ТК, в овуляции впервые было доказано в 1988 г. Thibault и Levasseur [11]. В 1998 г. в эксперименте на животной модели было доказано, что ТК участвуют в реализации действия эстрогенов, таких как рост и пролиферации клеток в матке в результате действия гепарина и гистамина [5]. В ряде других исследований доказано влияние эстрадиола и прогестерона на миграцию ТК в матку и их дегрануляцию, что далее может повлиять на имплантацию эмбриона [6]. При помощи электронной микроскопии были исследованы 16-недельные яичники плодов человека, было высказано предположение, что макрофаги и ТК могут являться локальными модуляторами синтеза стероидов [9]. Обнаружено, что периваскулярно расположенные ТК экспрессируют рецепторы для нейротрансмиттеров, нейропептидов, гормонов – кортикостероидов, кортиколиберина, 17â-эстрадиола, â-эндорфина, адреналина, лептина, мелатонина, паратгормона [10]. Этиологический фактор, приводящий к изменению фенотипа ТК и заставляющий избирательно секретировать определенные лиганды при различных условиях, в настоящее время неизвестен [10]. На экспериментальных моделях животных при индуцированном тиреотоксикозе выявлено увеличение IFNã, активная интерфолликулярная инфильтрация и дегрануляция ТК [13]. При индуцированном тиреотоксикозе и гипотиреозе происходит интратиреоидная дегрануляция ТК и нарушение баланса IFNã / IL- 10 [13]. Большинство исследований проведено на экспериментальных животных моделях, что свидетельствует о необходимости дальнейших исследований функций ТК в первичных клеточных культурах.

Целью исследования является изучение гормонпродуцирующей и цитокинпродуцирующей функции тучных клеток в первичной культуре в различных средах, моделирующих определенные гормональные условия, моделирование уровня гормонов в фолликулярной жидкости в момент овуляции для выявления участия ТК в развитии синдрома поликистозных яичников (СПКЯ).

Материалы и методы

Исследование одобрено Междисциплинарным этическим комитетом ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России (протокол № 9 от 16.05.2022 г.). Использовали постоянную линию тучных клеток человека HMC-1 (Human mast cell, ATCC). Биомассу ТК наращивали до эксперимента в среде IMDM (модифицированная по Дульбекко среда Игла, Sigma-Aldrich, США) с добавлением 20%-ной эмбриональной бычьей сыворотки FBS (Himedia, Индия), смеси заменимых аминокислот MEM NEAA (Gigbo, США), смеси незаменимых аминокислот MEM EAA (Sigma-Aldrich, США), 1 мМ пирувата натрия, 100 ед/ мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Gigbo, США). Затем клетки рассаживали в 6-луночный планшет с тремя видами сред: № 1 – содержала среду IMDM с добавками, описанными выше; среда № 2 – IMDM c добавками и гормонами – 7,5 мкг/мл дидрогестерона (АО «Верофарм», Россия), 0,00625 МЕ/мл лютеинизирующего гормона (Merck Serono Europe Ltd., Великобритания), 0,0125 МЕ/ мл фолликулостимулирующего гормона (Merck Serono Europe Ltd., Великобритания) и 1,25 мкг/мл эстрадиол (Delpharm Lille SAS, Франция) имитировала содержание гормонов в фолликулярной жидкости во время овуляции у здоровых доноров; среда № 3 – среда IMDM с добавками и гормонами – 0,00625 МЕ/ мл лютеинизирующего гормона, 0,0125 МЕ/мл фолликулостимулирующего гормона и 2,5 мкг/мл эстрадиол и дегидроэпиандростерона 5 мкг/мл, имитировала содержание гормонов в фолликулярной жидкости во время овуляции, как у пациенток с синдромом поликистозных яичников. Состояние клеток определяли с помощью флуоресцентных красителей с последующей проточной цитометрией перед посадкой клеток через 3 и 7 суток. Тучные клетки собирали из лунок планшета, осаждали центрифугированием при 500 g в течение 5 мин при комнатной температуре. К осадкам клеток из индивидуальных лунок добавляли 100 мкл смеси красителей на фосфатном буфере (Sigma-Aldrich, США): 4’,6 диамидино-2-фенилиндол (Sigma-Aldrich, США) в конечной концентрации 1 мкг/ мл для окрашивания мертвых клеток, H2DCFDA (Sigma-Aldrich, США) в конечной концентрации 10 мкг/мл для окрашивания клеток с функционально-активными митохондриями, TO-PRO-3™ (Thermo Scientific, США) в конечной концентрации 1 мкМ для окрашивания апоптотических клеток. Окрашивание производили в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого суспензии анализировали на проточном цитофлуориметре CytoFLEX S (Beckman Coulter, США), подключенном к компьютеру с лицензионным программным обеспечением CytExpert (v. 2.6, Beckman Coulter, США). Для анализа использовали 10 тыс. событий. Смену среды проводили каждые 3 суток. Среду после культивирования исследовали на содержание эстрадиола, прогестерона, тестостерона, IL-6.

Результаты и обсуждение

При анализе результатов проточной цитометрии, представленных на рисунке 1, нами продемонстрировано состояние ТК в первичной культуре, помещенной в различные среды, описанные выше. Количество активных тучных клеток на 3-и сутки эксперимента практически одинаково во всех средах: до эксперимента количество активных клеток 88,2%, на третьи сутки в среде № 1 их 93,5%, в среде № 2 активных ТК 94,1%, в среде № 3 активных ТК 93,9%, что свидетельствует об их нормальной переносимости добавления гормональных препаратов. На седьмые сутки эксперимента ситуация изменилась: в среде № 1 количество активных ТК стало 48%, в среде № 2 их уже 67% и в среде № 3 количество активных клеток составило 66,8%. Следовательно, добавление в среду эстрогенов, прогестерона и тестостерона не угнетало активность ТК, а наоборот, способствовало их активации. Показатели уровня гормонов и IL-6 при культивировании ТК в различных средах представлены на рисунках 1, 2, 3.

 

Рисунок 1. Содержание гормонов и IL-6 в среде № 1 при культивировании тучных клеток

Figure 1. Content of hormone and IL-6 levels in medium No. 1 during mast cells cultivation

 

Рисунок 2. Содержание гормонов и IL-6 в среде № 2 при культивировании тучных клеток

Figure 2. Content of hormone and IL-6 levels in medium No. 2 during mast cells cultivation

 

Рисунок 3. Содержание гормонов и IL-6 в среде № 3 при культивировании тучных клеток

Figure 3. Content of hormone and IL-6 levels in medium No. 3 during mast cells cultivation

 

Показатели практически всех гормонов в культуре ТК изменялись в зависимости от микроокружения ТК и времени продолжения эксперимента. Показатель прогестерона не изменился в среде № 1 без добавления гормонов и в среде № 3 с добавлением гормонов как при СПКЯ. В среде № 2 с созданием уровня гормонов как у здоровых доноров на 3-и и 7-е сутки произошло снижение показателя прогестерона в 4 раза в сравнении с исходными данными, но он оставался в 2 раза выше, чем в среде № 3. Все данные по содержанию прогестерона в культурах ТК могут свидетельствовать об отсутствии дополнительной секреции гормона тучными клетками в течение 7 суток нашего эксперимента.

Уровень эстрадиола прогрессивно нарастал в течение 7 суток эксперимента в каждой среде, что, собственно, служит дополнительным доказательством продукции эстрогенов тучными клетками [5, 7, 9]. В среде № 1, не содержащей стероидных гормонов, а только ТК и среду IMDM с негормональными добавками на 7-е сутки уровень эстрадиола вырос более чем в 80 раз, в сравнении с показателем уровня эстрадиола до размещения ТК в среду (рис. 1). В среде № 2, с добавлением гормонов как в фолликулярной жидкости здоровых доноров, ТК повысили уровень эстрадиола в 40 раз к седьмым суткам эксперимента (рис. 2). В культуре тучных клеток и среде № 3 с добавлением гормонов как у пациенток с СПКЯ в фолликулярной жидкости, уровень эстрадиола увеличивался более чем в 35 раз (рис. 3). Более того, следует отметить, что уровни ЛГ и ФСГ в 1-й среде были достаточно низкими, а во 2-й и 3-й средах аналогичные показатели были сравнимы между собой и значимо не повышались к концу эксперимента, что доказывает независимый от них синтез эстрадиола ТК de novo и требует дальнейшего изучения, так как ранее подобных исследований не проводилось.

Показатель тестостерона на 3-и сутки во всех трех средах с ТК нарастал и к 7-м суткам культивирования ТК в разных средах достигал своего максимального уровня. Тестостерон увеличился в среде № 1 более чем в 3 раза (рис. 1). В среде № 2 значения тестостерона увеличивались к 7-м суткам в 2,5 раза, а в среде № 3 показатель тестостерона увеличился максимально из всех в 8 раз (рис. 2, 3). Для доказательства самостоятельного синтеза тестостерона тучными клетками de novo требуется еще ряд экспериментов, так как значимо высокие были получены уровни эстрадиола. Кроме того, значимым на наш взгляд является полученное соотношение эстрадиол/тестостерон – в 1-й культуральной среде, где тучные клетки культивировались без добавления половых гормонов оно было физиологическим и составило 201 / 1, во второй и третьей средах соотношение было более высоким: 84000 / 1 и 1661 / 1 соответственно.

Показатели IL-6 во всех средах с культурой ТК значимо нарастали к 7-м суткам, но не превышали физиологические нормы цитокина у здоровых лиц, за исключением среды из культуры ТК с содержанием гормонов как при СПКЯ. Существенным доказательством самостоятельного синтеза цитокина тучными клетками (рис. 1, 2, 3) является его постепенное повышение во всех культуральных средах без дополнительной стимуляции антигенами на 3-и сутки и значимое нарастание по сравнению с 1-ми сутками к концу эксперимента на 7-е сутки, это не только не противоречит литературным данным [2], но и подтверждает роль IL-6 в патогенезе СПКЯ [1].

Заключение

В ряде исследований было высказано предположение и доказано, что тучные клетки влияют на репродуктивную систему [3, 5. 6, 7], в нашем исследовании получены доказательства способности тучных клеток не только акцептировать половые стероиды, но и реагировать на их содержание в микроокружении значимым нарастанием концентрации половых стероидов и IL-6 в культуральной среде. Значимое увеличение содержания эстрадиола, тестостерона и IL-6 в первичной культуре тучных клеток HMC-1 в различных средах, моделирующих определенные гормональные условия, зафиксированное нами, является подтверждением активного участия тучных клеток в репродуктивных процессах и, вполне вероятно, самостоятельного синтеза ТК указанных медиаторов, что потребует еще ряд экспериментов.

About the authors

O. V. Valikova

Pacific State Medical University; Regional Clinical Hospital No. 2; Plastek Surgery Cliniс

Author for correspondence.
Email: renalex.99@mail.ru

Junior Researcher; Clinical Endocrinologist

Russian Federation, Vladivostok; Vladivostok; Vladivostok

V. V. Zdor

Pacific State Medical University; Cliniс for Diabetes and Endocrine Diseases

Email: renalex.99@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Leading Researcher; Clinical Endocrinologist

Russian Federation, Vladivostok; Vladivostok

Ya. N. Tikhonov

Pacific State Medical University

Email: renalex.99@mail.ru

Senior Lecturer, Department of Pathological Anatomy

Russian Federation, Vladivostok

A. V. Boroda

A. Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology of the Far East Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: renalex.99@mail.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Deputy Director for Research

Russian Federation, Vladivostok

References

Supplementary files